Metody stanovení celkového proteinu v séru

Diety

Referenční hodnoty koncentrace celkového proteinu v séru jsou 65-85 g / l

2. Stanovení specifické hmotnosti séra

3. Hmotnost (gravimetrická), kdy se vysráží krevní proteiny, vysuší se do konstantní hmotnosti a zváží se na analytických stupnicích.

1. Refraktometr IRF-454 B2M

je určen k stanovení bílkovin v krevním séru, cerebrospinální tekutině, kontrole koncentrace léčiva, měření hustoty moči.

2. Cobas integra - celkový proteinový gen.2

Princip testu: dvojmocné mědi se nechá reagovat v alkalickém roztoku s proteinem peptidových vazeb, za vzniku charakteristického purpurová biuretovou komplex.

3. Stanovení bílkovinných frakcí krevního séra elektroforézou na filmu z acetátu celulózy.

Tlumivý roztok je určen k elektroforetické separaci sérových proteinů na membránách acetátu celulózy, následované denzitometrickým stanovením bílkovinných frakcí.

Princip elektroforetické separace proteinů je založen na různé rychlosti pohybu molekul sérových proteinů v konstantním elektrickém poli určité intenzity. Oddělené bílkovinné frakce jsou barveny barvivem. Intenzita zbarvení bílkovinných frakcí je úměrná jejich počtu.

Krevní sérum bez hemolýzy, lipemie a ne ikterické. Proteinové frakce v séru stabilní uzavřené zkumavce při teplotě 18-25 po dobu 8 hodin při teplotě 28 - po dobu 3 dnů při 20 ° C - do 1 měsíce.

1. Elektroforéza

1.1. suché membrány jemně položí na povrch elektroforézního pufru, vyhýbají se jejich rychlému ponoření a nasáknou až do úplného namočení. Mírně utěsněné membrány navlhčete mezi listy hustého filtračního papíru a zabraňte jejich vysušení. Před aplikací vzorků je vhodné provést předběžnou fázi. K tomu je nutno umístit membránu do komory pro elektroforézu a zapnout proud ve zvoleném režimu po dobu 10 minut. Fáze předřezání může být nahrazena dlouhým namáčením membrány v pufru (několik hodin).

1.2. s pomocí aplikátoru aplikujte analyzované vzorky séra ve vzdálenosti 2-3 cm od okraje katódy membrány. Umístěte membránu do elektroforetické komory a připojte proud.

2. Zpracování elektroforegramu

2.1. barvivo Crimson S.

Po vypnutí proudu opatrně přeneste membránu k roztoku barviva po dobu 3-5 minut, pak dvakrát po dobu 3 minut v 5-7% roztoku kyseliny octové (před bělení na pozadí).

1.2. Elektroforem by měl být zpracován pomocí skeneru a počítačového programu.

4. Vzorek Tim

Sérové ​​beta-globuliny, gama globuliny a lipoproteiny se sráží při pH 7,55 thymolovým činidlem. V závislosti na množství a vzájemném poměru proteinových frakcí se v reakci vyvine zákal, jehož intenzita se měří turbidimetricky.

Timolovaya test je vhodnější pro funkční vyšetření jater než vzorky odolné proti koloidům. Předpokládá se, že je pozitivní v 90 až 100% případů Botkinovy ​​choroby (již v pre-artritické fázi a bez anus) a toxické hepatitidy. Reakce je pozitivní v případě post-hepatitidy a post-nekrotických, zejména ikterické cirhózy (na rozdíl od jiných forem cirhózy), s kolagenovými onemocněními, malárií a virovými infekcemi. U mechanického žloutenka je to (v 75% případů) negativní, což má rozdílnou diagnostickou hodnotu.

Při mechanické žloutence se vzorek stává pozitivním pouze v případě, že proces je komplikován parenchymální hepatitidou. Pro odlišení obstrukční žloutenky z parenchymu velký význam je použití thymolu se sondou Burstein (pro beta a pre-betalipoproteidy).

Při parenchymální žloutence jsou obě vzorky pozitivní, s mechanickou žloutenkou, tymolový test je negativní, Bursteinův test je ostře pozitivní.

Přednáška: STANOVENÍ VŠEOBECNÉHO PROTEINU V SÉRIku krve

Výsledky experimentů Tabulka 3.

OBSAH ZPRÁVYOTÁZKY PRO SAMOSTAVENÍ

6.1. Jaké úrovně strukturní organizace proteinové molekuly víte? Jaké vazby se týkají jejich stabilizace?

6.2. Co je denaturace bílkovin? Jaké úrovně strukturální organizace jsou zničeny?

6.3. Jaké denaturační látky jsou známy? Jaké vazby v molekule bílkovin primárně ničí?

6.4. Co určuje rozpustnost proteinu? Jaké faktory stabilizují protein v roztoku?

6.5. Co znamená reverzibilní a nevratné srážení proteinů? Jaké reakce srážení bílkovin jsou reverzibilní? Jaké reakce srážení bílkovin jsou nevratné?

6.6. Co způsobuje nevratné reakce srážení bílkovin? Jejich aplikace v lékařské praxi.

6.7. Bude bílkovina koagulovat z roztoku v přítomnosti přebytku kyseliny nebo alkálie? Proč?

6.8. Bude protein precipitovat za působení: 1) nízkých koncentrací roztoku chloridu sodného; 2) vysoké koncentrace roztoku chloridu sodného; 3) nízké koncentrace roztoku chloridu rtuťnatého?

6.9. Co je vysychání z bílkovin? Jaký je účel vysychání v medicíně?

6.10. Co určuje náboj molekuly bílkoviny v roztoku?

6.11. Definujte izoelektrický bod proteinu. Jak mohu najít protein IET?

6.12. Určete směr pohybu proteinu pI = 4,6, pokud je frakcionován elektroforézou v pufru s pH = 8,2.

STANOVENÍ VŠEOBECNÉHO PROTEINU V KRMO SÉRII

ÚČEL PRÁCEPŘIDĚLENÍTEORETICKÁ ČÁST

Obsah celkového proteinu v krevním séru (plazmě) lze charakterizovat koncepcemi normo-, hypo- a hyperproteinemie, kterými se rozumí stavy, které jsou doprovázeny normálními (nepřesahujícími limity fyziologických výkyvů), sníženou nebo zvýšenou koncentrací. Normální obsah celkového proteinu v krevním séru je: u dospělých - 65-85 g / l, u novorozenců - 46-60 g / l, u dětí do 2 let - 51-75 g / l, po dobu 2 let - 60-85 g / l.

Změny úrovně celkového proteinu mohou být také absolutní, a relativní. Ty se obvykle zaznamenají s nárůstem (poklesem) objemu krve. Tak polyplasmia ( „voda“ otrava), hojný infuze roztoku glukózy a dalších fyziologických tekutinách, anurii, hypersekrece antidiuretického hormonu aldosteronu a které podporují zadržování vody v těle, vést k vývoji relativní hypoproteinemii; dehydratace (dehydratace) v důsledku ztráty kapaliny v průběhu anacatharsis, hojné průjem, cholera, diabetes insipidus, pocení (horečka), polyurie zjištěna relativní Hyperproteinemie.

S převážnou většinou nemocí vnitřních orgánů, doprovázených posuny metabolismu bílkovin, hypoproteinemie, medvědi obvykle sekundární získané přírodě (primární hypoproteinemie dochází poměrně zřídka, a je geneticky určená vada dochází v důsledku na geny kódující určité sérové ​​proteiny, jako je například -. analbumineniya, agamaglobulinémie et al).

Absolutní hypoproteinemie je detekován v patologických stavech, ve kterých dochází ke snížení biosyntézy, zvýšeného katabolismu nebo zvýšené ztrátě bílkovin. Nejběžnějšími důvody jsou:

1. Nedostatek dietní příjem bílkovin, obvykle pozorovány podvýživy, hladovění, nádorů, zúžení jícnu, poruchy funkce gastrointestinálního traktu (v důsledku degradace trávení bílkovin a absorpce složek potravin), při prodloužené zánětu ve střevech. Podle A.A. Pokrovsky, dokonce i nevyvážené složení aminokyselin v potravinách může někdy vést k hypoproteinémii.

2. Inhibice funkce proteosinteticheskoy jater pozorovány v parenchymu jater, stejně jako otrava způsobená dlouhými hnisavých procesů malignity působení některých chemických jedů. Postižené jaterní buňky, které jsou místo tvorby albuminu, fibrinogenu a globulinů části, které nebyly schopny syntetizovat plazmatické bílkoviny v dostatečném množství, aby se rozvíjející hypoproteinemie při hlavně hypoalbuminemia a hypofibrinogenemie.

3. Zvýšení rozkladu bílkovin v těle způsobené potřebou obnovit velké náklady na energii spojené s nedostatkem plastových zdrojů (popálení, maligní novotvary, hypertyreóza, hyperkortikismus atd.).

4. Ztráta tělesné proteinu s krví při akutní a chronické krvácení vylučování v nefrotického syndromu, přes poškozené střevní sliznice (malabsorpce) a kůže (psoriasis, rozsáhlých popálenin, atd.).

Snížený obsah bílkovin v krevní plazmě je pozorován i za určitých fyziologických podmínek, například u žen v posledních měsících těhotenství a během laktace.

Je třeba poznamenat, že pro zajištění normálních životních procesů používá tělo hypoglykemické proteiny primárně pro albuminovou frakci plazmatických bílkovin. Se zvýšenou konzumací albuminů, která určují hlavně onkotlak v krvi, vznikají edémy, které jsou patrné v patologických stavech, spolu s poklesem obsahu bílkovin v krevní plazmě pod 50 g / l. Je také dobře známo, že polovina vápníku v krevní plazmě je navázána na albumin. Proto je hypoalbuminémie téměř vždy doprovázena hypokalcemií. V tomto případě se snižuje pouze frakce vápníku, která je asociována s proteinem (fyziologicky neaktivní), což nevede k rozvoji tetany a záchvatů. Jednou z důležitých funkcí albuminu je vazba a transport bilirubinu, volných mastných kyselin a mnoha léků (např. Salicyláty, penicilin a sulfonamidy). Léčiva související s albuminem jsou fyziologicky a farmakologicky neaktivní. Výrazné snížení plazmatického albuminu, které vede k poklesu vazebné kapacity, může zvýšit hladinu volných frakcí výše uvedených látek, což může mít za následek toxické účinky při obvyklých dávkách léků.

Absolutní hyperproteinémie - poměrně vzácný jev. To je obvykle způsobeno zvýšením biosyntézy globulinů v buněčných prvcích fagocytárního mononukleárního systému (kvůli jejich infekčním nebo toxickým podrážděním) s prodlouženými probíhajícími chronickými zánětlivými procesy. To je pozorováno zejména u chronické polyartritidy, jaterní cirhózy a některých chronických procesů.

Významný a přetrvávající albuminosis - až do 120 g / l a je fixována v mnohočetným myelomem (plazmocytomu), makroglobulinémie Valdenshtrema, což má za následek plochých kostí lebky existují další tvorba ložiska „abnormální“ nebo patologických proteinů - paraproteiny. Proto, v případě, že pacient odhalilo vysoký obsah celkového proteinu v krevní plazmě, měl by být dále vyhodnocovány pro identifikaci těchto forem abnormálních proteinů.

Detekce abnormálních proteinů v séru (paraproteinemie) nejčastěji vidět v patologických stavů, na základě genezi, které jsou zhoubné novotvary: mielomatoz, který odpovídá za většinu případů maligní paraproteinémie; B-buněčné lymfomy, včetně chronické lymfocytární leukémie; onemocnění spojená s abnormalitami těžkého řetězce imunoglobulinu, které obsahují skupinu vzácně se vyskytujících chorob, charakterizovaných akumulaci v krevní plazmě nebo v moči abnormálního proteinu identifikovaného s fragmentem H řetězce. Odkazuje na paraproteinémie skupiny a kryoglobulinemie, ve kterém krevní plazmě pacientů odhalila přítomnost kryoglobuliny, které zahrnují proteiny, vysrážený po ochlazení vzorků v krevní plasmě nižší teplotě lidského těla. Někdy, zvláště pokud je koncentrace bílkovin vysoká, intravaskulární srážení může způsobit kožní léze, jako je purpura nebo fenomén Raynaud.

Z výše uvedeného je hypoproteinemie téměř vždy spojena s hypoalbuminemií a hyperproteinemií s hyperglobulinemií.

U mnoha nemocí se procento jednotlivých proteinových frakcí často mění, i když celkové množství bílkovin v séru zůstává v normálních mezích. Tento stav se nazývá deproteinemie. Například, vzhledem k relativně nízké molekulové hmotnosti, dochází ke ztrátě značného množství albuminu za podmínek, které jsou charakterizovány zvýšenou permeabilitou biologických membrán oddělujících krevní plazmy z intersticiální tekutiny. Proto, v případě, zánětlivé reakce na poranění, kvůli zvýšené propustnosti cév, je „pocení“ albuminu do intersticiální tekutiny, což vede ke snížení jeho koncentrace v plasmě - Hypoalbuminémie. Nicméně, v plazmě se zvyšuje frakce rychle globulin frakce (zejména a-globuliny, které obsahují ve svém složení proteinů akutní fáze reakční složky nebo g-globulin), které se obvykle nemění celkovou koncentraci sérového proteinu. Současně dochází k prudké změně poměru různých proteinových frakcí krevní plazmy.

OBJEDNÁVÁNÍ VÝKONUKvantitativní stanovení celkového obsahu bílkovin v krevním séru metodou biuretu

V současné době známé metody kvantitativního stanovení proteinů v krevním séru lze rozdělit na kolorimetrickou, založenou na barevné reakci proteinů s určitými činidly; spektrofotometrické, sestávající z měření stupně absorpce světla v ultrafialové oblasti a dalších. Z kolorimetrických metod je třeba věnovat zvláštní pozornost metodám založeným na biuretové reakci. Jsou velmi přesné, prakticky přístupné a založené na schopnosti bílkovin reagovat v alkalickém prostředí síranem měďnatým, čímž se tvoří komplexní sloučeniny fialové barvy. Současně jsou rozdíly v intenzitě zbarvení komplexů tvořených albuminy a globuliny nevýznamné, což umožňuje použití této metody k detekci hladiny téměř všech sérových proteinů.

Průběh práce

K 5 ml pracovního roztoku biuretového činidla se přidá 0,1 ml krevního séra. Po 30 minutách při Feke kolorimetriruyut vzorku v kyvetě s tloušťkou vrstvy od 10 mm se zeleným filtrem (546 vlnová délka nm) ve srovnání s kontrolou, která se připravuje přidáním 5 ml biuretu činidla, pracovní roztok 0,1 ml 0,9% NaCl. Výpočet se provádí podle kalibrační křivky.

Konstrukce kalibrační křivky. Z 10% standardního proteinkového roztoku v 0,9% roztoku chloridu sodného se připraví standardní pracovní roztoky, jak je uvedeno v tabulce 10 (0,1 ml standardního zásobního roztoku obsahuje 0,01 g bílkoviny). Z každého ředění odeberte 0,1 ml pracovního roztoku a přidejte do zkumavek obsahující 5 ml biuretového činidla. Po 30-60 minutách se změří zánik standardních vzorků u FEC proti kontrole.

Průměrné hodnoty optické hustoty, odpovídající různým koncentracím, jsou aplikovány na milimetrový papír. Na úsečce jsou zakresleny koncentrace standardních proteinových roztoků a odpovídající hodnoty optické hustoty na osy osy. Prostřednictvím získaných bodů se nakreslí přímka.

Údaje pro konstrukci kalibrační křivky pro kvantifikaci koncentrace celkového proteinu v krevním séru jsou uvedeny v tabulce 4.

Data pro sestavení kalibračního grafu Tabulka 4

Obecný protein, jeho význam a metody stanovení (Strana 1 z 2)

MUSE «KLIMATICKÁ NEMOCNICE SPOLEČNOSTI AMBULANCE SERVICE»

SEVERNÍ STÁTNÍ LÉKAŘSKÁ UNIVERZITA

KURZ KLINICKÉ LABORATOŘNÍ DIAGNOSTIKY

Obecný protein, jeho význam a metody pro stanovení

Arkhangelsk, 2008

Proteiny krevní plazmy

Metody stanovení celkového proteinu v séru

Seznam použité literatury

Proteiny jsou vysokomolekulární organické sloučeniny obsahující dusík sestávající z více než 20 typů alfa-aminokyselin. Podmíněná hranice mezi velkými polypeptidy a bílkovinami je molekulová hmotnost 8000 až 10000. Plazmatické proteiny se syntetizují primárně v játrech, plazmatických buňkách, lymfatických uzlinách, slezině a kostní dřeni.

Plasma lidské krve obsahuje více než 100 různých proteinů, které se liší původem a funkcemi. Z 9-10% suchého zbytku krevní plazmy je podíl proteinů 6,5-8,5%.

· Jednoduché (bílkoviny) (obsahují pouze aminokyseliny)

· Komplexní (proteidy) (aminokyseliny a neaminokyselinové složky: hem, deriváty vitamínů, lipidy nebo uhlohydráty)

· Fibrilár (tvorba mnoha hustých tkání)

· Globulární (albuminy (4-5%), globuliny (2-3%), fibrinogen (0,2-0,4%)

Existují následující funkční třídy proteinů:

- Transportní bílkoviny (transferin)

- Proteiny akutní fáze (C-reaktivní protein)

- Proteiny akutní fáze (albumin, transferin)

- Faktory komplementu a srážlivosti (komplement C4, faktor VIII)

- Antifenčení (antitrombin III)

- Proteiny, jejichž funkce nejsou dostatečně studovány (kyselina alfa-glykoproteinová)

Fyziologická funkce plazmatických proteinů je pro udržení koloidně osmotického tlaku, pufrovací kapacita plazmy, v některých případech - uložení (skladování) lipidových molekul, metabolické produkty, hormony, léky a minerálů. Některé plazmatické proteiny mají enzymatickou funkci, imunoglobuliny provádějí humorální imunitu. Složky komplementu a C-reaktivní protein, jsou důležité pro nespecifickou odolnost, a to zejména v případě bakteriálních infekcí. Rovnováha mezi koagulační faktory a inhibitory poskytnout kapalný stav krve v normálním a rychlé koagulaci v případě zranění

Proteiny krevní plazmy

Normable hodnota 56,5-66,8 (na sérový albumin, představuje přibližně 60% z celkového proteinu syntetizován v játrech albuminu (asi 15 g / den), zatímco jejich poločas je okolo 17 dnů v plazmě onkotického tlaku vzhledem k 65-80% albumin Albuminy působí... přepravě důležitou funkci mnoha biologicky aktivních látek, zejména hormony. Tyto sloučeniny jsou schopné vázat se na cholesterol, bilirubin. Většina vápníku v krvi je také spojován s albumin. albumin schopné vazby s různými léky.

Jak kvalitativní, tak i kvantitativní změny plazmatického albuminu jsou možné. Kvalitativní změny albuminů jsou velmi vzácné kvůli homogennímu složení této bílkovinné frakce; kvantitativní změny se projevují hyper- a hypoalbuminemií.

Hyperalbuminemie se vyskytuje při dehydrataci v případech těžkých poranění, s rozsáhlými popáleninami, cholerou.

Hypoalbuminémie jsou primární (u dětí v důsledku nezralosti jaterních buněk), a sekundární, v důsledku různých patologických stavů, podobných těm, které způsobují hypoproteinemii. Při snížení koncentrace albuminů může hemodiluce také hrát roli, například v těhotenství. Snížení obsahu albuminu pod 22-24 g / l je doprovázeno vývojem plicního edému.)

· Alpha 1 - 3,5 - 6,0 (hlavní složky této frakce zahrnují α1 antitrypsin, α1 - lipoprotein, kyselina α1 - glykoprotein) (Změna frakce α1 - globuliny jsou pozorovány při akutní, subakutní exacerbaci chronických zánětlivých procesů; poškození jater; všechny procesy rozpadu tkáně nebo proliferace buněk. Snížení hodnoty α1 - globuliny jsou pozorovány s deficiencí α1 - antitrypsin, hypo-α1 - lipoproteinemie.)

· Alfa 2 - 6,9 - 10,5 (frakce obsahuje α2 - makroglobulin, haptoglobin, alipoproteiny A, B (apo-A, apo-B), C, ceruloplasmin) (zvýšení2 - globulin pozorováno u všech typech akutních zánětlivých procesů, zejména s výrazným exsudativní a hnisavé (pneumonie, empyémem, jiné hnisavé procesy); onemocnění spojená s postižením pojivové tkáně v patologickém procesu (kolagenózy, autoimunitní onemocnění, revmatické onemocnění); zhoubných nádorů; ve fázi zotavení z tepelných popálenin; nefrotický syndrom; hemolýza krve in vitro. Snížené frakce pozorované u diabetu, pankreatitida (někdy), kongenitální žloutenka mechanický původ u novorozenců, toxická hepatitida. K α2 - Globuliny zahrnují většinu bílkovin akutní fáze. Zvýšení jejich obsahu odráží intenzitu stresové reakce a zánětlivých procesů uvedených typů patologie.

· Beta - 7,3 - 13,0 (β-frakce obsahující transferrin, hemopexin, složky komplementu, imunoglobulin a lipoproteiny) (zvětšení beta globulin frakce byla detekována v primární a sekundární hyperlipoproteinémie, onemocnění jater, nefrotického syndromu, krvácející vřed, hypotyreóza Snížení obsahu hodnotu. beta-globulin je detekován s gopo-beta-lipoproteinemií.

· Gama - 12,8 - 19,0 (γ-frakce obsahuje Ig (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE), čímž se zvyšuje obsah y-globulinů poukázat na imunitního reakčního systému, kdy výstup AT a autoprotilátky: ve virových a bakteriálních infekcí, zánětu,. kolagenóza, degradace tkáně a mnohem popáleniny hypergammaglobulinemia, odrážející zánětlivý proces aktivita je typická pro chronicky aktivní hepatitidy a jaterní cirhóza zvyšující se podíl y -. globuliny pozorována u 88-92% pacientů s chronickou aktivní hepatitidy (ve které 60-65% pacientů je nesmírně vyjádřeno -. až 26 g / l a vyšší) mají téměř stejné změny zaznamenané u pacientů s vysokou aktivitou a s pokročilou cirhózou jater, přičemž často obsah γ-globulin překročí obsah albuminu, který je považován za špatný prognostický znak.

V některých chorob případného zvýšení syntézy proteinů, které spadají do frakce γ-globulin, a objeví se v krevních patologických proteinů - paraproteinů která byla zjištěna pomocí elektroforézy. K objasnění povahy těchto změn je nutná imunoelektroforéza. Podobné změny jsou zaznamenány u myelomu u Waldenstromovy nemoci.

Zvýšení hladin gama-globulinů byly pozorovány u revmatoidní artritidy, lupus, chronickou lymfocytární leukémií, endotelioma, osteosarkom, kandidóza.

Snížení obsahu γ-globulinu je primární a sekundární.

Existují tři hlavní typy primární hypogamaglobulinémie: fyziologické (u dětí ve věku 3-5 let), vrozené a idiopatické. Příčiny sekundární hypogamaglobulinémie mohou být četné nemoci a stavy vedoucí k vyčerpání imunitního systému.

Srovnání směru změny v obsahu albuminu a globulinu a celkových změn v obsahu proteinů poskytuje základ pro závěr, že albuminosis často spojené s hyperglobulinaemia, zatímco hypoproteinemie je obvykle kvůli hypoalbuminemia. V minulosti se běžně používá výpočet poměru albuminu-globulin, tedy poměr frakce albuminu k množství globulinové frakce. Obvykle je toto číslo 2,5-3,5. U pacientů s chronickou hepatitidou a cirhóza jater, tento poměr se sníží na 1,5 až 1, a to i snížením albuminu a globulin frakce zvýší. V posledních letech se stále více a více pozornost je věnována definování obsahu prealbuminu, a to zejména u pacientů s těžkým intenzivní péče na parenterální výživě. Snížení koncentrace prealbuminu - nedostatkem brzy a citlivý test bílkovin v těle pacienta).

Koeficient A T se obvykle používá jako index poměru albuminu k globulinu.

Změny v tomto koeficiente lze pozorovat při cirhóze, glomerulonefritidě, nefrotickém syndromu, akutní hepatitidě, systémovém lupus erythematosus.

Koncentrace bílkovin v krevní plazmě závisí na poměru mezi rychlostí jejich syntézy a vylučováním z těla, stejně jako distribučním objemem.

Mnoho proteinů se tvoří v játrech, plazmatické buňky a lymfocyty syntetizují imunoglobuliny, makrofágy jsou proteiny komplimentového systému. Pasivní ztráta bílkovin s nízkou molekulovou hmotností nastává skrze ledvinový glomerul a střevní stěnu. Některé z těchto proteinů procházejí reabsorpcí nebo jsou zachyceny a štěpeny v střevní sliznici. Většina plasmových proteinů po jejich zachycení pomocí pinocytózy je katabolizována v endotelových buňkách kapilár nebo mononukleárních fagocytů.

Fyziologické role proteinů krve jsou četné, hlavní jsou následující:

· Udržovat koloidní-onkotický tlak, udržovat objem krve, vážit vodu a držet ji, neumožňovat opustit krevní oběh;

· Účast na koagulaci krve;

· Udržovat stálost krve krve, tvořící jeden z vyrovnávacích systémů krve;

· Spojení s množstvím látek (cholesterol, bilirubin atd.), Stejně jako s léky, jsou dodávány do tkání.

· Udržení normálních hladin krevních kationtů sloučeniny tvořící s nimi nedialyzované (například, 40-50% sérového kalcia vzhledem k proteinům, významná část železa, mědi, hořčíku a dalších stopových prvků, jsou také spojeny s proteiny);

Metody stanovení celkového krevního proteinu

Metody pro stanovení celkového proteinu v krevním séru jsou založeny na různých principech:

· Spektrofotometrická - na stanovení absorpce při 280 nm,

· Fotometrická - měření barevných reakčních produktů,

Refraktometrická - na stanovení lomů lomu nebo refrakčních koeficientů světla.

Nejběžnější jsou metody refraktometrické a fotometrické biurety. Při biuretové reakci se atom mědi váže na dusíkové atomy proteinu, čímž vzniknou barevné sloučeniny.

Princip metody: peptidové vazby proteinu s měděnými solemi v alkalickém prostředí tvoří komplex fialové barvy (biuretová reakce).

Reagencie:

1. Chlorid sodný: 9 g v 1 litru. vody.

2. Hydroxid sodný: 8 g. Do 1 litru vody.

3. Jodid draselný: 30 mmol / l roztok jodidu draselného v 0,2 mol / l roztoku hydroxidu sodného; 0,5 g jodidu draselného se umístí do odměrné baňky o objemu 100 ml, upraví se na hodnotu 0,2 mol / l roztokem hydroxidu sodného.

4. Vínan sodný draselný 4-vody (sůl Rochelle).

5. Síran měďnatý 5-vody.

6. biuretu činidlo: 4,5 g Rochellovy soli se rozpustí ve 40 ml 0,2 mol / l roztoku hydroxidu sodného se přidá 1,5 g síranu měďnatého a 0,5 g jodidu draselného a rozpustí. Doplňte roztokem hydroxidu sodného 0,2 mol / l do 100 ml. Reagencie jsou stabilní při skladování v tmavých skleněných tabulích

7. Pracovní roztok biuretového činidla: 20 ml biuretového činidla se smísí s 80 ml 0,5% roztoku jodidu draselného. Roztok je stabilní.

8. Kalibrační roztok albuminu: 100 g / l roztoku albuminu v roztoku chloridu sodného 154 mmol / l.

Postup stanovení: Zkušební vzorek: Do 0,1 ml krevního séra se přidá 5 ml pracovního roztoku biuretového činidla a směs se míchá. Po 30 minutách měření na fotometru v kyvetě s tloušťkou vrstvy 1 cm při vlnové délce 500-560 nm (filtr ze zeleného světla) proti vzorku slepého vzorku. Prázdný test: přidejte 0,1 ml roztoku chloridu sodného 154 mmol / l do 5 ml pracovního biuretového činidla a poté jej upravte jako zkušební vzorek. Výpočet se provádí podle kalibračního plánu.

Konstrukce kalibračního grafu: ředění se připraví z 10% kalibračního roztoku albuminu. Vezměte 0,2 ml; 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml; 1,0 ml se upraví roztokem chloridu sodného na 1 ml. Koncentrace v první trubky je rovna 20 g / l albuminu ve druhém - 40 g / l, ve třetím - 30 g / l, ve čtvrtém - 80 g / l, v pátém - 100 g / l. Z každého ředění brát 0,1 ml pracovního roztoku a bylo přidáno k 5 ml pracovního činidla, biuret; po 30 - 60 minutách naměřených na fotometru, jako v experimentu, proti vzorku slepého vzorku. Na základě získaných dat je sestaven kalibrační plán.

Normální hodnoty: 65-85 g / l (6,5-8,5 g / 100 ml).

Metody stanovení celkového proteinu v séru

Referenční hodnoty koncentrace celkového proteinu v séru jsou 65-85 g / l

2. Stanovení specifické hmotnosti séra

3. Hmotnost (gravimetrická), kdy se vysráží krevní proteiny, vysuší se do konstantní hmotnosti a zváží se na analytických stupnicích.

1. Refraktometr IRF-454 B2M

je určen k stanovení bílkovin v krevním séru, cerebrospinální tekutině, kontrole koncentrace léčiva, měření hustoty moči.

2. Cobas integra - celkový proteinový gen.2

Princip testu: dvojmocné mědi se nechá reagovat v alkalickém roztoku s proteinem peptidových vazeb, za vzniku charakteristického purpurová biuretovou komplex.

3. Stanovení bílkovinných frakcí krevního séra elektroforézou na filmu z acetátu celulózy.

Tlumivý roztok je určen k elektroforetické separaci sérových proteinů na membránách acetátu celulózy, následované denzitometrickým stanovením bílkovinných frakcí.

PRINCIP METODY

Princip elektroforetické separace proteinů je založen na různé rychlosti pohybu molekul sérových proteinů v konstantním elektrickém poli určité intenzity. Oddělené bílkovinné frakce jsou barveny barvivem. Intenzita zbarvení bílkovinných frakcí je úměrná jejich počtu.

ANALYZOVANÉ VZORKY

Krevní sérum bez hemolýzy, lipemie a ne ikterické. Proteinové frakce v séru stabilní uzavřené zkumavce při teplotě 18-25 po dobu 8 hodin při teplotě 28 - po dobu 3 dnů při 20 ° C - do 1 měsíce.

PROVÁDĚNÍ ANALÝZY

1. Elektroforéza

1.1. suché membrány jemně položí na povrch elektroforézního pufru, vyhýbají se jejich rychlému ponoření a nasáknou až do úplného namočení. Mírně utěsněné membrány navlhčete mezi listy hustého filtračního papíru a zabraňte jejich vysušení. Před aplikací vzorků je vhodné provést předběžnou fázi. K tomu je nutno umístit membránu do komory pro elektroforézu a zapnout proud ve zvoleném režimu po dobu 10 minut. Fáze předřezání může být nahrazena dlouhým namáčením membrány v pufru (několik hodin).

1.2. s pomocí aplikátoru aplikujte analyzované vzorky séra ve vzdálenosti 2-3 cm od okraje katódy membrány. Umístěte membránu do elektroforetické komory a připojte proud.

2. Zpracování elektroforegramu

2.1. barvivo Crimson S.

Po vypnutí proudu opatrně přeneste membránu k roztoku barviva po dobu 3-5 minut, pak dvakrát po dobu 3 minut v 5-7% roztoku kyseliny octové (před bělení na pozadí).

1.2. Elektroforem by měl být zpracován pomocí skeneru a počítačového programu.

4. Vzorek Tim

Sérové ​​beta-globuliny, gama globuliny a lipoproteiny se sráží při pH 7,55 thymolovým činidlem. V závislosti na množství a vzájemném poměru proteinových frakcí se v reakci vyvine zákal, jehož intenzita se měří turbidimetricky.

Timolovaya test je vhodnější pro funkční vyšetření jater než vzorky odolné proti koloidům. Předpokládá se, že je pozitivní v 90 až 100% případů Botkinovy ​​choroby (již v pre-artritické fázi a bez anus) a toxické hepatitidy. Reakce je pozitivní v případě post-hepatitidy a post-nekrotických, zejména ikterické cirhózy (na rozdíl od jiných forem cirhózy), s kolagenovými onemocněními, malárií a virovými infekcemi. U mechanického žloutenka je to (v 75% případů) negativní, což má rozdílnou diagnostickou hodnotu.

Při mechanické žloutence se vzorek stává pozitivním pouze v případě, že proces je komplikován parenchymální hepatitidou. Pro odlišení obstrukční žloutenky z parenchymu velký význam je použití thymolu se sondou Burstein (pro beta a pre-betalipoproteidy).

Při parenchymální žloutence jsou obě vzorky pozitivní, s mechanickou žloutenkou, tymolový test je negativní, Bursteinův test je ostře pozitivní.

Metody stanovení celkového proteinu v séru

Proteiny séra jsou heterogenní skupina proteinů, včetně transportních proteinů, enzymů, imunoglobulinů, hormonů, inhibitorů proteinů a mnoha dalších. Navzdory rozdílům v složení, struktuře, fyzikálních a chemických vlastnostech a provedené funkci mají sérové ​​proteiny řadu společných vlastností:

  1. obsahují atomy uhlíku, vodík, kyslík, dusík;
  2. sestávají z aminokyselin spojených peptidovými vazbami;
  3. Absorpce v ultrafialové oblasti spektra;
  4. chovají se podobně v řadě chemických reakcí.

Vycházejíc z těchto obecných vlastností byly vyvinuty metody pro stanovení bílkovin v biologických tekutinách.

Metody stanovení celkového proteinu

Mezi způsoby stanovení koncentrace celkového proteinu lze rozlišit několik hlavních skupin založených na různých principech:

  • azotometrická;
  • gravimetrická (hmotnost);
  • "Srážení";
  • spektrofotometrický;
  • refraktometrický;
  • kolorimetrický.

Navíc k těm uvedeným výše byly vyvinuty i další metody, například fluorometrické, polarimetrické, stejně jako metody atomové absorpční spektrofotometrie a aminokyselinová analýza proteinu.

Azotometrické metody

Azotometricheskie metody pro stanovení celkové bílkoviny v séru je založena na stanovení množství proteinu dusíku, což vede k destrukci aminokyselin, které tvoří proteiny. Metoda byla poprvé navržena Kjeldahlem v roce 1883. V Kjeldahlovou metodou, nyní představuje celý historický význam, dusík obsažený ve složení proteinů, se oxidují na amoniový iont a jeho přesné množství se stanoví titrací s kyselinou chlorovodíkovou. Kromě toho, amonný iont se může stanovit Nesslerova činidlem, manometrické metody po konverzi amonného iontu do molekulárního dusíku působením bromnanu, nebo pomocí optického zkušebního Warburg působením enzymu glutamát dehydrogenázy. v tom, že proteiny z biologických objektů obsahují v průměru o 16% dusíku, získané analýzou dusíku násobený koeficientem 6,25 na bázi. Historicky, použití faktor 6,25, i když jeho hodnota je závislá na proteinové složení vzorku. Pro separaci proteinových frakcí v rozmezí koeficientů séra nebo plazmy z 5,69 na 6,52.

Nevýhodou metod měření dusíku je trvání a složitost postupu, i když amoniak vytvořený v reakci může být stanoven enzymatickou metodou. Automatizace umožňuje použití této metody v řadě případů jako srovnávací metoda kvůli její dostatečné přesnosti a reprodukovatelnosti.

Gravimetrické metody

Gravimetrické (hmotnostní) metody pro stanovení celkového syrovátkového proteinu jsou založeny na sušení proteinů na konstantní hmotnost a vážení na analytických stupnicích. Metody jsou namáhavé a nyní se prakticky nepoužívají k určení celkového obsahu syrovátkové bílkoviny. Gravimetrická metoda je v některých laboratořích používána k určení fibrinogenu v krevní plazmě.

Metody "srážení"

„Pretsipitatsionnye“ Metody pro stanovení celkové bílkoviny jsou založeny na snížení rozpustnosti proteinů a tvorbu suspenze částic pod vlivem různých činidel. Na obsahu proteinu v testovaném vzorku se posuzuje buď intenzity světla rozptylu (nefelometricky analýzy), je definován počtem světelných rozptylových částic, nebo ke zmírnění zavěšení světelného toku vede (turbidimetrické metoda test).

Výsledky této skupiny metod závisí na různých faktorech: rychlosti míchání činidel, teplotě reakční směsi, pH média, přítomnosti cizích sloučenin, metody fotometrie. Pečlivé dodržování reakčních podmínek podporuje tvorbu stabilní suspenze s konstantní velikostí suspendovaných částic a produkce reprodukovatelných výsledků. Metody "srážení" pro stanovení bílkovin v séru nebyly rozpoznány a použity při stanovení bílkovin v moči, mozkomíšním moku a mnoha individuálních proteinech, které používají specifické protilátky.

Spektrofotometrické metody

Spektrofotometrické metody pro stanovení celkového proteinu krevního séra jsou založeny na měření absorpce světla v ultrafialové oblasti.

Proteinové roztoky mají absorpci při 270-290 a 200-225 nm. Absorpce při 270-290 nm je určena přítomností aromatických aminokyselin - tyrosinu, tryptofanu a fenylalaninu v proteinové molekule. Absorpce při 200-225 nm je téměř 20krát vyšší než při 280 nm a je způsobena především peptidovými vazbami.

Přesnost a specifičnost metod stanovení proteinů na základě absorpce při 270-290 nm je malá, protože obsah tyrosinu a tryptofanu může kolísat v různých proteinech krevního séra. Navíc přítomnost určité volby v séru volných aminokyselin - tyrosinu a tryptofanu, kyseliny močové a bilirubinu, které absorbují při 280 nm, představuje určitou chybu. V tomto ohledu se tato metoda nepoužívá k přímému stanovení celkového obsahu bílkovin v séru.

Naopak, absorpce v ultrafialové oblasti - 200 - 225 nm je způsobena hlavně peptidovými vazbami, a proto absorpce různých proteinů v séru se nevýznamně liší. V tomto spektrálním rozmezí je zákon o pivu pozorován při koncentraci sérových proteinů až 120 g / l.

Stanovení celkového sérového proteinu přímou fotometrií při 210 nm poskytuje výsledky srovnatelné s biuretovou metodou a Kjeldahlovou metodou. Současně se tato metoda prakticky nepoužívá kvůli potřebě použití kyvety, které neabsorbují při 210 nm, a monochromátoru, což zvyšuje náklady na způsob.

Refraktometrické metody

Refraktometrické metody pro stanovení celkové bílkoviny v séru na základě schopnosti proteinových řešení lomu světla. Při teplotě 17,5 ° C, indexu lomu vody je 1,3332 při stejné teplotě, index lomu séra se pohybuje mezi 1,3480-1,3505. Vzhledem k tomu, že koncentrace elektrolytů a neproteinové organické sloučeniny ovlivňující jeho optickou lámavost je nízká a dostatečně konstantní ve zdravém lidském séru, je hodnota indexu lomu krevního séra je závislá především na jeho obsahu proteinů. Kalibrujte přístroj sérem se známou koncentrací bílkovin. Jednoduchosti refraktometrie pohodlný způsob pro stanovení celkového obsahu proteinu v séru, i když v řadě onemocnění, zejména diabetes, chronické selhání ledvin, jeho použití může vést k významné chyby.

Kolorimetrické (fotometrické) metody

Kolorimetrické metody pro stanovení celkového proteinu jsou založeny na barevné reakci proteinů s činidly vytvářejícími chromogenitu nebo na nespecifické vazbě barviva.

Mezi kolorimetrických metod pro stanovení celkové koncentrace bílkoviny v séru nejčastěji posuzovaného testu biuretu na základě takzvaného „barevné biuretu reakce“, při které se bílkoviny nechá reagovat v alkalickém prostředí, s síranu měďnatého, za vzniku sloučenin barvené ve fialové barvy, intenzita barvy závisí na koncentraci celkové proteinu v séru. Biuret Test pro stanovení celkové bílkoviny v krevním séru bylo potvrzeno, že v roce 1972 sjednoceny

Kolorimetrické metody pro stanovení celkového proteinu krevního séra jsou poměrně jednoduché a poměrně levné. Nevýhodou metody je interferující účinek některých látek (včetně léků).

Jiné metody pro stanovení celkového sérového proteinu

Fluorometrická a další moderní metody pro stanovení celkové bílkoviny (např., Polyarigrafichesky mikrometodou nebo analýza atomové absorpce) vykazují vysokou citlivost a specifičnost, nicméně, je třeba zadat speciální zařízení a někdy i speciální kvalifikace analytik spolu s stanovení dostatečně vysoké hodnotě činí tento výzkum metoda domény a významně omezuje jeho použití v klinické laboratoři.

Literatura:

  • Příručka "Laboratorní metody výzkumu na klinice", vydané Menshikov VV - Moskva, "Medicine", 1987
  • A.V. Kozlov A. V., Slepysheva V. V. - Stanovení bílkovin v krevním séru.
  • Lékařská biochemie: Laboratorní seminář na téma Semikolenova NA - Omsk, vydavatelství Státní univerzity v Omsku, 2005

Související články

Kvantitativní metody pro stanovení celkového obsahu bílkovin v moči

Pro kvantitativní stanovení bílkoviny je vhodný jakýkoliv vzorek moči. Většina vědců, kteří určují velikost denních ztrát proteinů, dává přednost stanovení obsahu bílkovin v moči za den.

Sekce: Analýza moči

Celkový obsah bílkovin v séru

Pod pojmem "celkový protein krevní séra" se rozumí velké množství proteinů přítomných v krevním séru a jejich struktura, fyzikálně-chemické vlastnosti, funkce. Všechny proteiny v krevním séru jsou rozděleny na albumin a globuliny. V krevní plazmě kromě albumin a globulinů také obsahuje fibrinogen, takže celkový obsah bílkovin v krevní plazmě je o něco vyšší než v séru.

Sekce: Klinická biochemie

Stanovení celkového proteinu v séru podle biuretové reakce

Stanovení celkového proteinu biuretovou reakcí je zdaleka nejběžnější metodou pro stanovení celkového proteinu v séru. Metoda je poměrně levná, jednoduchá, má dobrou reprodukovatelnost a specifičnost, její využití umožňuje provádět výzkum jak na analyzátorech (automatické a poloautomatické), tak na konvenčním fotometru.

Sekce: Klinická biochemie

Protein v moči: metody pro stanovení

Patologická proteinurie je jedním z nejdůležitějších a trvalých příznaků onemocnění ledvin a močových cest. Určení koncentrace bílkovin v moči je povinným a důležitým prvkem močového testu.

Sekce: Analýza moči

Fotometrické metody pro stanovení močoviny

Fotometrické metody pro stanovení močoviny jsou založeny na reakci močoviny s různými látkami s tvorbou barevných sloučenin. Mezi fotometrickými metodami pro stanovení močoviny jsou nejčastější metody založené na reakci močoviny s diacetylmonoximem.

Sekce: Klinická biochemie

Veterinární technologie

Jste tady

Stanovení celkového sérového proteinu biuretovou reakcí

Zásada. Proteiny reagují v alkalickém prostředí měďnatou sírou; čímž vznikly sloučeniny fialové.
Reagencie. 1. 0,9% roztok chloridu sodného.
2. 0,2 N; (0,2 mol / l) roztoku hydroxidu sodného bez oxidu uhličitého. 8 tun látky se zavádí do odměrné baňky na 1 litr a vylije se k desce vroucí destilovanou vodou nebo se připraví z 1N. (mol / l) roztoku louhu sodného: 20 ml 1 N kyseliny chlorovodíkové. Roztok NaOH se přenese na 100 ml vroucí destilovanou vodou.
3. Biuretové činidlo je základní. 4,5 g Rochelleovy soli (KNaC4H4O6) se rozpustí ve 100 ml odměrné baňce ve 40 ml 0,2 N kyseliny chlorovodíkové. roztok louhu sodného. Po rozpuštění se přidá 1,5 g síranu měďnatého (CuS04 * 5H2O) a 0,5 t jodidu draselného (KI). Míchá se až do úplného rozpuštění a přivede se na 100 ml 0,2 N. roztok louhu sodného. Skladujte v misce s tmavým sklem. Reagencie jsou stabilní. 4. 0,5% roztok jodidu draselného v 0,2N. roztok louhu sodného. Do odměrné baňky o objemu 500 ml se přidá 2,5 g jodidu draselného a naplní se značkou 0,2 N. roztok louhu sodného. Skladujte v misce tmavého skla nejdéle 2 týdny.
5. Pracovní roztok biuretového činidla. Část základního biuretového roztoku (3) se smíchá se čtyřmi díly 0,5% roztoku jodidu draselného (4). Uchovávejte v chladničce v tmavých pokojích nejdéle 2 týdny.
6. Standardní albuminový roztok, základní. 1 g krystalické syrovátky (z lidského nebo hovězího séra) albuminu a 9 ml 0,9% roztoku chloropentu se vnese do zkumavky. Míchejte důkladně. 1 ml roztoku obsahuje 0,1 g bílkovin. Uchovávejte v chladničce. Sérový albumin by měl splňovat požadavky normy.
Zařízení. Fotoelektrokolorimetr; žárovky jsou měřeny.
Průběh definice. K 0,1 ml krevního séra se přidá 5 ml pracovního roztoku biuretového činidla, promíchá se, čímž se zabrání tvorbě hélia. Po 30 minutách (ale ne později než 1 hodinu) Optická hustota se měří při Feke v kyvetě s tloušťkou vrstvy 1 cm při vlnové délce 540-560 nm (zelená filtru) ve srovnání s kontrolou (5 ml pracovního roztoku biuretu činidla a 0,1 ml 0, 9% roztok chloridu sodného).
Výpočet se provádí podle kalibračního plánu, pro který jsou připraveny standardní standardní roztoky základního standardního roztoku 10% bílkoviny (tabulka 5).
5. Příprava pracovních standardních bílkovinných roztoků
Z každého (ze 4) ředění v 5 zkumavkách se přidá a zpracuje 0,01 ml roztoku albuminu, stejně jako krevní sérum.
Měření optické hustoty standardních roztoků začíná roztokem s nejnižší koncentrací. Z průměrných získaných dat je z 5 stanovení vytvořena kalibrační křivka. Kalibrační křivka se periodicky kontroluje.
Poznámka: 1. Obsah bílkovin standardního roztoku by měl být nejméně 7%. 2. Je-li obsah bílkovin v séru vyšší než 10%, roztok se zředí fyziologickým roztokem 1: 1, výsledek se vynásobí dvěma. Chyba metody 2%.
Zdroj: Klinická laboratorní diagnostika ve veterinární medicíně: Referenční příručka / IP. Kondrakhin, N.V. Kurilov, A.G. Malakhov a dr. -M: Agropromizdat, 1985.-287p.

Laboratorní diagnostika

Rychlé vyhledávání na webu

Sdílet na sociálních sítích

Přečtěte si nás na:

Nalezli jste chybu? Vyberte ji myší a současně stiskněte klávesy Ctrl + Enter systému Orphus

Celková bílkovina

Všechny známé metody pro stanovení koncentrace celkového proteinu jsou rozděleny do následujících skupin:

1. Azotometrická analýza založená na stanovení množství bílkovinného dusíku za účelem zjištění koncentrace proteinu vychází ze skutečnosti, že obsah dusíku v proteinech je 16%, proto se používá koeficient 6.25. Metoda je nepřesná, protože obsah dusíku různých proteinových molekul se pohybuje od 14 do 19%.

2. Metody spočívající v určení sérové ​​hustoty - metoda plovoucí kapky, jsou také nepřesné kvůli vlivu na hustotu ostatních látek přítomných v séru.

3. Hmotnost (gravimetrická) - velmi namáhavá a vyžaduje velké množství séra.

4. Refraktometrické metody - jednoduché provedení, ale nepřesné, protože refrakce séra je také podmíněna minerálními látkami a sacharidy.

5. Kolorimetrická, založená na barevných reakcích bílkovin:

  • metody založené na barviva nespecifické vazby (jednoduché absorpce), jsou dostatečně citlivé, ale stupeň vazby barviva závisí na individuálních vlastnostech proteinu (metoda Coomassie Brilliant Blue).
  • biuretu test - nejpoužívanější v současné době založeno na specifické reakci peptidové vazby s ionty mědi v alkalickém prostředí za vzniku fialové produktu. Existují různé modifikace této metody s cílem zvýšit intenzitu barvy a její stabilitu, což zvyšuje stabilitu činidla. Například, tartrát se přidá jako stabilizátor, který po komplexaci s ionty mědi zabraňuje jejich sedimentaci v alkalickém prostředí, KJ zabraňuje samovolnému alkalické zotavení vinan mědi a ukládání oxidu mědi, a tím zvyšuje stabilitu činidla. Senzitivita a specificita testu je závislý na použité vlnové délce: 540-580 nm, 263 nm nebo 310 nm. Tato metoda je považována za specifickou a přesné, protože přítomnost aromatických aminokyselin, fenoly, kyselina močová neovlivňuje biuretovou reakci.
  • Lowry metoda - založené na tvorbě wolframu a molybdenu modré z modré fosfomolybdenové a fosfowolframové soli Folin Chikolte jejich reakcí s aromatickými aminokyselinami, tyrosinových zbytků obecně, ale určitý příspěvek je tryptofan, histidin, cystein. Maximální absorpce je v rozmezí 745-750 nm. V pracovním činidle je biuretové činidlo, které umožňuje také stanovení peptidových vazeb. Nevýhody tohoto způsobu jsou: za prvé, negativní vliv na vývoj barevných materiálů pro izolaci, čištění a solubilizaci proteinů (mycí, pufrovací systémy, komponenty a dalších sulfhydrylové redukčními činidly, purin, glycin, sacharóza, síran amonný, atd.); za druhé, nepřítomnost lineární závislosti intenzity barvy na množství bílkovinných standardů. Tato metoda je citlivější než biuretu, ale jeho specifičnost je nižší, jako intenzita barvy závisí na protein aminokyselinové složení a sekvenci aminokyselin a stupni stínění z funkčních skupin.

6. Nefelometrické metody.

7. Polarimetrické metody.

8. Spektrofotometrické spočívající v měření stupně cvetopogloscheniya v ultrafialové oblasti při dvou vlnových délkách s další výpočet podle zvláštních vzorců (230 a 260 nm, 280 nm a 260, 235 a 280 nm, 215 nm a 225, 280 a 205 nm).

Jednotné metody

Jednotné metody pro stanovení celkového proteinu jsou:

  • v krevním séru - metoda biuretu;
  • v moči semikvantitativní metoda Brandenburg-Roberts-Stolnikov a nefelometrie (590-650 nm) po reakci se sulfosalicylovou kyselinou;
  • v tekutině - nefelometrii (410-480 nm) po reakci se sulfosalicylovou kyselinou a síranem sodným;
  • v tekutině serózních dutin - nefelometrie (590-650 nm) po reakci se sulfosalicylovou kyselinou.

Stanovení celkového množství bílkovin
v krevním séru za použití biuretové metody

Zásada

Proteiny reagují v alkalickém prostředí se síranem měďnatým a vytvářejí chelátové sloučeniny fialové barvy. Intenzita barvy je úměrná počtu peptidových vazeb.

Následující Článek

Leyfferon, kolik je