Virologické metody výzkumu

Diety

Virologické metody výzkumu jsou široce používány v lékařství pro diagnostiku různých infekčních a určitých onkologických onemocnění virové povahy.

Metody virologického výzkumu se také používají k identifikaci virů, ke studiu jejich biologie a schopnosti ovlivňovat zvířata a lidi, což dále pomáhá porozumět patogenezi virových onemocnění a zvolit správné metody jejich léčby. Kromě stanovení etiologie onemocnění a sledování účinnosti terapie mají virologické metody výzkumu velký význam při definování a provádění antiepidemických opatření.

Přímé metody výzkumu virologie

Přímé virologické metody vyšetření mohou detekovat virus, virovou nukleovou kyselinu nebo virový antigen přímo v klinickém materiálu a jsou tak nejrychlejší (expresní metody - až 24 hodin). Tyto metody jsou méně informativní a vyžadují laboratorní potvrzení nepřímými diagnostickými metodami v souvislosti s častým přijetím falešně negativních nebo falešně pozitivních výsledků. Následující metody šetření jsou přímé:

  • elektronová mikroskopie s barvením virů metodou negativního kontrastu (umožňuje stanovit přítomnost viru a jeho koncentraci v materiálu za předpokladu, že v 1 ml obsahuje ne méně než 105 virových částic);
  • Imunitní elektronová mikroskopie založená na interakci specifických protilátek s viry za účelem vytvoření komplexů, které jsou snadněji detekovány s negativním kontrastem než samotné viry;
  • (ELISA) pomocí enzymem značených protilátek, které se vážou na antigeny, tvořící komplexy identifikované přidáním substrátu pro použitý enzym;
  • imunofluorescenční reakce (RIF) - přímá nebo nepřímá - je založena na použití protilátek spojených s fluorescenčním barvivem;
  • radioimunoanalýza (RIA) je založena na použití radioaktivně značených protilátek a gama-čítačů;
  • cytologické metody jsou založeny na mikroskopickém vyšetření zbarvených skvrn, biopsických vzorků, pitva;
  • molekulární metody - molekulární hybridizace nukleových kyselin a polymerázová řetězová reakce (první je založen na detekci komplementárních řetězců nukleových kyselin se značkou, a druhý - na virově specifických sekvencích DNA replikaci v podstatě ve třech stupních).

Existují tři varianty molekulární hybridizace nukleových kyselin: bodová hybridizace, blotová hybridizace (používá se k diagnostice infekce HIV) a in situ hybridizace (přímo v infikovaných buňkách). PCR (polymerázová řetězová reakce) je nyní stále častěji používána při monitorování a diagnostice virových infekcí kvůli vysoké citlivosti a specificitě této metody.

Nepřímé virologické metody vyšetřování

Tyto metody jsou založeny na identifikaci a identifikaci viru. Jsou to časově náročnější a zdlouhavější techniky, nicméně přesnější. Materiál pro takové studie může být obsah váčků, stěry (planým neštovicím, herpetických lézí kůže a sliznic), nosohltanu mytí (respirační infekce), krvi a mozkomíšním moku (pro arbovirus infekce), stolicí (pro enteroviru infekce) promývací kapaliny (s spalničky, zarděnka atd.). Vzhledem k tomu, že viry mohou replikovat pouze v živých buňkách, kultivaci viru se provádí v tkáňové kultuře, kuřecích embryí nebo v těle zvířete (křečků, bílé myši, psi, kočky, některé druhy opic). Údaj o viru neseného cytopatického efektu, v gemadsorbtsii reakce na barevný vzorek, výsledky inhibice hemaglutinace, na změny nebo jeho nedostatek v kuřecích embryí nebo tkáňových kultur, přežití citlivých zvířat.

Serologické diagnostické metody používané v virologii

Sérologická diagnóza znamená virologické výzkumné metody založené na reakci antigen-protilátka. Nejčastěji se používají párové krevní séra, které se užívají v intervalech několika týdnů. Když se titr protilátek zvýší 4x nebo více, je reakce považována za pozitivní. K určení typu virů se za účelem stanovení specifičnosti skupiny použije neutralizační reakce viru, reakce fixace komplementu. Pasivní hemaglutinace, inhibice hemaglutinace, zpětná pasivní hemaglutinace, RIF a různé varianty enzymového imunoanalýzy jsou také široce používány.

V nedávné době se v průběhu studií genetického inženýrství vyvinula technika pro získání monoklonálních protilátek. Úzká specifičnost monoklonů je překonána použitím několika monoklonálních protilátek k různým virovým determinantům. To zvýšilo citlivost a specificitu virologických výzkumných metod s definicí virových antigenů. V současnosti je pro imunologickou diagnostiku virových infekcí vytvořeno mnoho různých testovacích systémů.

Metody studia virů.

Historicky virologie točil pryč od mikrobiologie, a to i mikrobiologické techniky nebylo možno použít při práci s viry, jako obecné zásady, jako aseptických podmínek, čímž se získá čisté linie, titračních metod, a konečně, očkování, tvořil základ nového vědy. Další studie nejdůležitějších vlastností virů vyžadovala vývoj řady speciálních metod. To znamená, že schopnost virů projít bakteriální filtr byl použit k určení jejich velikosti a čisté, malá velikost virů, stimuluje tvorbu sofistikovanějších mikroskopie. Technické arzenál of Virology postupně obohacen metody fyziky, chemie, genetiky, cytologie, molekulární biologie a imunologie.

Byly měřeny a zváženy viry, jejich chemické složení, vzory reprodukce, místo v přírodě, role v původu nemocí a vyvinout účinné metody boje proti virovým infekcím. Viry jsou pěstovány zvláštními metodami, infikováním laboratorních zvířat, kuřecího embrya a tkáňové kultury. Na počátku virologie byly provedeny studie na laboratorních zvířatech (bílé myši, morčata, králíci). Zavedli "podezřelý materiál" a posoudili podle vzorce onemocnění, jaký virus způsobil. Pro rozmnožování a izolaci virů se kromě laboratorních zvířat začalo používat i kuřecí embrya, u kterých se některé viry dobře množily, hromadily se, někdy až do značné míry.

Od počátku padesátých let se vyvinula metoda tkáňové kultury: buňky živé tkáně jsou odděleny enzymy, přeneseny do speciální sterilní misky, přidává se komplexní živné médium a umístěno do termostatu pro růst. Buňky se začínají rozdělovat a postupně pokrývat povrch skla rovnoměrnou spojitou vrstvou. Jsou-li takové buňky infikovány virem, pak jejich destruktivní účinek může být pozorován přímo. Metoda tkáňové kultury umožnila otevření nových virů a studium interakce virů a buněk.

Izolace, množení a identifikace druhů virů jsou hlavními metodami praktické virologie. Tato práce se obvykle skládá ze dvou hlavních částí: studium buněk infikovaných virem a studium izolovaných virů.

Pro detekci infikovaných buněk se používají různé metody virologické diagnostiky: metoda fluorescenčních protilátek, která umožňují jasně identifikovat přítomnost virů v buňkách, které se zdá být externě neinfikovány; způsob záznamu rychlosti a povahy násobení viru založený na destrukci (úplných nebo částečných) buněk. Důležitou roli v diagnostice virových infekcí je stanovení titrů specifických protilátek v séru pacientů pomocí různých imunologických reakcí - neutralizace, fixace komplementu, zpoždění hemaglutinace atd.

II. Vlastnosti struktury a reprodukce virů

Po dlouhou dobu byla existence virů posuzována podle jejich patogenních účinků. Přímé vidění virů bylo možné až po vynalezu elektronového mikroskopu, což způsobilo nárůst desítek a stovek tisíckrát. Stalo se to asi 50 let po objevení virů.

Největší viry se blíží velikosti malých bakterií, nejmenších molekul s velkými bílkovinami, například k molekule hemoglobinu v krvi. Jinými slovy, mezi viry existují obři a trpaslíci. Pro měření virů se používá podmíněná hodnota nazvaná nanometr (nm). Jeden nanometr je miliontina milimetru. Velikost různých virů se pohybuje od 20 do několika set metrů. Pro srovnání dáme hodnotu nejmenších krevních buněk - erytrocytů, která se rovná 7000-8000 nm, tj. viry jsou méně než červené krvinky v desítkách a stokrát. Podle vzhledu těla virů připomínají kostky, tyčinky, koule, polyhedra a vlákna.

Jednoduché viry se skládají z proteinů a nukleových kyselin. Nejdůležitější částí virové částice je nukleová kyselina - je nosičem genetické informace. Pokud se lidské buňky, zvířata, rostliny a bakterie vždy obsahují dva druhy nukleových kyselin - deoxyribonukleové - DNA a ribonukleové - RNA z různých virů detekované pouze jeden typ - buď DNA nebo RNA, které tvoří základ jejich klasifikace. Druhou povinnou součástí virionu - proteiny se liší mezi různými viry, což jim umožňuje rozpoznat pomocí imunologické reakce.

Složitější viry kromě proteinů a nukleových kyselin obsahují sacharidy, lipidy. Každá skupina virů má vlastní sadu proteinů, tuků, sacharidů a nukleových kyselin. Některé viry obsahují enzymy.

Každá složka virionu má specifické funkce: proteinový plášť chrání před nepříznivými účinky, nukleová kyselina je zodpovědný za dědičné a infekční vlastnosti a hraje hlavní roli v variability viru, a enzymy podílející se na jejich reprodukci. Typicky, je nukleová kyselina se nachází v centru virionu a je obklopen proteinovým obalem, jako by na sobě. Kapsid je tvořena určitým způsobem podobné naskládaných proteinových molekul, které vytvářejí symetrický geometrický tvar, společně s nukleovou kyselinou virů. V případě, že krychlový symetrie nukleokapsidového řetězci nukleové kyseliny, je vrácena do kuličky a kapsomerů jsou pevně zabalené kolem něj. Uspořádány tak, polioviry, slintavce a kulhavce, adenovirus reoviry, rhinovirů a další. S spirály (tyčová) symetrie viru nukleokapsidového řetězec nukleové kyseliny, šroubovitě stočený, každé kolo svých vztahuje kapsomer těsně vedle sebe. Struktura kapsomerů a vzhled virionů lze pozorovat pomocí elektronové mikroskopie.

Obrázek 3 - Schéma struktury viru lidské imunodeficience (1 - kapsomery, 2 - genom, 3 - lipoproteinová obálka (super capsid), 4 - glykoprotid)

U komplexně uspořádaných virů je jádro ve formě těsně skládané šroubovice pokryto jednou nebo více vnějšími plášti, které obsahují různé látky. Taková struktura má například viru neštovic, chřipky a parainfluenzy. Struktura virových bakterií - bakteriofágů (fágů), která se skládají z hlavy a ocasu, byla podrobně studována. Fág koncový protein cheholchike oblečeni, který běží na dlouhé tenká vlákna, které hrají roli přísavek pokud je vázán na bakterie fágových částic.

Datum odevzdání: 2016-06-22; zobrazení: 1281; OBJEDNAT ZÁZNAM PRÁCE

Metody vyšetřování virů

VIRUSOLOGICKÉ VÝZKUMY - studie prováděné za účelem diagnostiky virových infekcí, studií příslušných patogenů, jejich rozšíření v přírodě a také při přípravě virových přípravků. Ve virologických laboratořích (viz) med. Profil studována jako lidských virů, takže v některých případech, živočišné viry (např., Provést diagnózu vzteklině u psů, zvířata vyšetření, který se používá k výrobě virových preparátů). Metody zkoumání obojího jsou podobné.

Jedna z hlavních etap V. a. je izolace virů. Při izolaci virů od lidí se používá krev, různé tajemství a exkrety, kousky orgánů. Nejčastěji se vyšetřuje krev u arbovirových onemocnění. Používaná celá defibrinovaná nebo hemolyzovaná krev, některé její složky nebo sraženiny (v pozdních stádiích onemocnění). V slinách se nacházejí viry vztekliny, epidemie, parotitis, herpes simplex. Nasofaryngeální výplachy slouží k izolaci patogenů chřipky, spalniček, psitakózy, rhinovirů, respiračního syncyciálního viru, adenovirů. Při propláchnutí spojivky se také objevují adenoviry. Promytí se provádí opláchnutím nosu a hltanu (zvlášť) a promytím spojivky izotonickým roztokem chloridu sodného. Můžete otřít nosní průchody a zadní stěnu hltanu s tampony navlhčenou ve vývinu. Nesterilní materiál je ošetřen antibiotiky (1000 jednotek penicilinu a streptomycinu na ml) po dobu 30 minut. Z výkalů jsou izolovány různé enterovirusy, adeno- a reovirusy. Vzorky se zředí 1: 10 fosfátovým pufrem, dvakrát odstřeďují po dobu 20 minut. při 8000 ot / min za minutu. Antibiotika se přidávají, jak je uvedeno výše. Méně často pro V. a. vzít obsah pustul (s neštovicemi, kuřecí neštovicí, herpes) a bodkovaných orgánů (s venerickým lymfogranulomem). Sekční materiál by měl být proveden co nejdříve po smrti těla. Skladuje se až do doby vyšetřování při t ° -20 ° a níže. Provedení V. a. tkanina je drcena (mletá) a 10-20% kaše se připravuje na izotonickém roztoku chloridu sodného nebo živném médiu pro buněčné kultury. Centrifuguje se 20 minut. při 1500 ot / min; Supernatant se používá pro další vyšetřování.

Pro izolaci virů jsou infikovány laboratorní zvířata, ptačí embrya, buněčné a tkáňové kultury. Zvířata jsou vhodná, pokud způsobí, že virem mají jasné klinické příznaky onemocnění nebo pathoanatomické změny (např. Paralýza, pneumonie atd.). Z tropismu viru závisí účinnost jednoho nebo druhého způsobu zavádění materiálu. Široce užívaná infekce pod kůží, intraperitoneálně a intravenózně. Neurotropní viry jsou detekovány, když jsou zvířata na mozkové hemisféře infikována (arbovirem, virus vztekliny atd.), Vizuální kopč (poliovirus v experimentech na opicích), míchu. Virusy neštovice a herpesu mohou být detekovány aplikací materiálu na králíky na rozštěpené rohovce. Některé viry mohou být snadno detekovány inokulací do přední komory oka (např. Virus hepatitidy psů v experimentu štěněte). Pro studium příčinných činitelů respiračních infekcí se obvykle používá intranazální infekce zvířat (pohřbívání materiálu v nosu anestetizovaného zvířete nebo jeho zavedení ve formě aerosolu do speciální komory). V zažívacím traktu je materiál injektován potravou nebo ústy tupou jehlou. Při studiu některých onkogenních virů se používá metoda infekce zlatých křečků do sliznice tvářecích pouzder.

K mnoha virům, novorozeným zvířatům a krmivům jsou náchylnější k sexuálně zralým jedincům. Sací myši jsou široce používány k izolaci arbovirů a Coxsackie virů (po infekci do mozku). Některé adenoviry jsou schopné indukovat nádory s podkožní infekcí novorozených zlatých křečků. Studie o počtu ptačích virů se provádí na kuřata prvních dnů života.

Použití kuřecích embryí má několik výhod. Jejich nediferencované tkáně mají širokou škálu citlivosti na mnoho virů. Přítomnost infekce se posuzuje smrtí embrya, vzhled změny (důlková koroze) na chorio-Alantoidní membránou (obr. 1), hromadění tekutin v embryonálním hemaglutinin a doplňovat vázající antigen viru. Embrya inokulované chorioallantoidní membráně (ve věku 11 - 12 den pox virus skupina) do alantoické a amniotické dutin (10 až 11-denní miksovirusami), žloutkového váčku (ve věku 5-6 dnů patogeny psittakozaornitoza et al.). Očkování materiálu do embryí v mozku a intravenózně (do cév membrán) se provádí zřídka. S jakýmikoli způsoby infekce mohou být embrya traumatizovány, takže ti, kteří byli zabiti v prvních 24-48 hodinách. z účetnictví.

Pro studium vlivu chem. látky jsou velmi výhodné de-embryonizované vejce, ve kterých je embryo odstraněno, ale dochází k zachování chorionaleantoické membrány. Uvnitř vložte virus a látku do 20 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Otvor ve skříni je uzavřen víčkem s trubičkou, pomocí níž můžete odebírat vzorky pro analýzu.

Při hodnocení pokusů na zvířatech a embryích ptáků je třeba mít na paměti možnost vyvolání latentních infekcí nebo izolace latentního viru.

Rozsáhle pro izolaci a akumulaci virů se používají buněčné a tkáňové kultury (viz). Tyto metody lze použít k pěstování většiny známých virů (viz Kultivace virů). Některé z nich se intenzivně akumulují již během primární infekce plodin, jiné vyžadují několik pasáží. Reprodukce většiny virů v buněčných kulturách je doprovázena vývojem cytopatického účinku. Vzhledem ke své povaze do určité míry může být posouzena na viry, které patří k určité závod: pikornaviry způsobují zaoblení a buňky smršťování, adenovirus - tvorba shluků oblých buněk ve formě hrozen, miksovirusy a herpetické viry - tvorba vícejádrové syncytia. Řada virů nelze pěstovat mimo tělo.

Reprodukce některých virů (neštovice, myxo a arboviry) může být detekována pomocí hemodysorpční reakce, protože postižené buňky získají schopnost adsorbovat červené krvinky. Odpovídající erytrocyty (člověk, opice, morčata, kuře) v koncentraci 0,4 až 0,5% se umístí na monovrstvu při t ° 4 ° nebo při pokojové teplotě po dobu 20 až 30 minut. Erytrocyty jsou difundovaně adsorbovány v celé kultuře (např. Parainfluenzní viry) nebo tvoří islety (chřipkové viry, příušnice).

Násobení viru se někdy posuzuje vyšetřením kulturní tekutiny na zvířatech (klíšťová encefalitida) nebo v DSC. Přítomnost viru, který nemá cytopatickou aktivitu, je někdy určena jeho schopností interferovat s cytopatogenním virem. V kulturách buněk kuřat embryí infikovaných viry ptačí leukémie je potlačena reprodukce viru Rausova sarkomu. K detekci necytopatogenních kmenů hovězího průjmu a cholery prasat je navržena metoda END (exaltace viru newcastleské choroby), což je superinfekce kultur s virem newcastleské choroby. Při kombinovaném působení obou virů dochází k destrukci buněk.

Když se objeví cytopatické změny nebo jiné známky násobení viru, kultivační tekutina se používá k identifikaci viru nebo průchodu. Řada virů zůstává navázána na buňky i v případě kultivační degenerace (adenoviry, virové neštovice), čímž se zmrazí a rozmrazí kultury před sběrem tekutiny. Některé herpetické viry, například virus Marekovy choroby u kuřat, musí být transplantovány spolu s intaktními buňkami.

Pro studium virů lidských respiračních korun a některých dalších je použita metoda tkáňové kultury, tj. Infekce kultivovaných fragmentů in vitro v tkáni. Nejčastěji používaným tkání je trachea králíka. Vícenásobný virus postihuje endotelové buňky slizniční membrány, které jsou určeny ukončením pohybu řas.

Je třeba vzít v úvahu možnost vzniku cizích virů v kulturách tkání a buněk. Mohou být zavedeny s buňkami, pokud jsou získány z infikovaného organismu, z trypsinu nebo séra, které se používají k kultivaci buněk.

Navíc k setí nebo sekční bioptického již narostlé kultury, které se přímo kultivace buňky zkoumány orgán po trypsinizaci často účinnější proti izolaci viru (např., Detekce adenoviru v mandlí). Také se používá se mísí kultury postupu, kdy se zkušební těleso buňky rostou společně s jakýmkoliv virem, citlivou na daných buněk (např., Setí buňky v mozku pacientů s subakutní sklerotizující panencefalitidy s opičích ledvinových buněk nebo Hela-buněk pro izolaci viru spalniček). Metoda smíšené kultury je často jediným způsobem izolace viru od nádorů, které tento virus vyvolává u zvířat, které nevytvářejí aktivní virus, ale které obsahují virový genom.

Jednovrstvé buněčné kultury umožňují získat kolonie virových plaků (obr. 2). Plaky zpravidla tvoří viry, které mají cytopatickou aktivitu. Současně tato metoda umožňuje detekci některých necytopatogenních virů (např. Řady kmenů viru hovězího průjmu). Pro získání plaků se virus aplikuje na buněčnou monovrstvu v šálcích nebo plochých lahvích. Množství infekce, tj. Počet virových částic na buňku, by mělo být malé, takže vzniklé plaky se nesluší. Po 30-60 minutách. vrstvený adsorpční prostředek s 1,35 až 1,5% agaru, a neutrální červeně v konečném ředění 1: 000. Kultura ve 40 Petriho misky se inkubují v atmosféře s 5 až 10% oxidu uhličitého a, a hermeticky uzavřených lahvičkách - v běžné troubě. Po několika dnech se mezi buňkami zabarvenými po celý život začínají objevovat nelakované ložiska degenerovaných buněk.

Na buňky můžete umístit agar bez neutrální červené barvy a po několika dnech aplikovat druhou vrstvu agaru s barvivem; plaky se stanou viditelnými po několika hodinách. Agar někdy obsahuje sulfáty polysacharidů, které jsou inhibitory růstu viru; Pro jejich neutralizaci se do média přidá protamin sulfát (60 mg na 100 ml). Pro získání plaků řady virů lze jako nátěry použít methylcelulózu a jiné látky. Některé viry (neštovice, spalničky) tvoří plaky a bez agaru. Způsob plaku umožňuje klonovou analýzu virových kmenů. K izolaci geneticky homogenních klonů se extrahuje jeden plak, který se používá pro další infekci. Obvykle se provádí klonování pro tři průchody.

Způsob plaků je také vhodný pro stanovení počtu buněk produkujících virus (tj. Počtu infekčních center) v infikované kultuře. K tomu jsou buňky suspendovány, umístěny na jednovrstvou kultivaci indikátorových buněk citlivých na virus a naplněny agarem. Kolem infikovaných buněk tvoří plaky.

Pro diagnostiku virových infekcí a studium antigenní struktury virů se použije srážecí reakce v gelu. Nejčastěji se k tomuto účelu používá agar. Antigeny a specifické protilátky umístěné v agarovém gelu v určité vzdálenosti difundují a tvoří sraženinu ve formě bílých pásů. 0,8 až 1% agaru v izotonickém roztoku chloridu sodného nebo fosfátovém pufru se umístí do kapilár nebo vrstvených na sklíčkach. Antigeny jsou přednostně purifikovány a koncentrovány. Přísady reakce se aplikují na agar na protilehlé konce kapiláry nebo do jamek vytvořených v agarové vrstvě na skle ve vzdálenosti 5 až 6 mm. Inkubace trvá 4-20 hodin.

Značný počet V. a. jsou prováděny světelnou a elektronovou mikroskopií. Největší viry (např. Neštovice) po vhodné léčbě (stříbření, barvení Victoria atd.) Lze zjistit konvenční světelnou mikroskopií. Tato metoda se používá při diagnostice neštovic zkoumaním materiálu z pustul. Pro některé infekce je charakteristická tvorba inkluzí telok v buňkách. Takže v jádrech jsou včlenění pro herpetickou a adenovirovou infekci, v cytoplazmě - s neštovicemi (corpuscle Guarnieri) a vzteklinou (tělo Babesh-Negri). Detekce inkluzí je důležitá pro diagnózu vztekliny, neštovice, cytomegalie, subakutní sklerotizující panencefalitidy a dalších.

Mikroskopie v tmavém poli (viz mikroskopie Darkfielda) a fázově kontrastní mikroskopie (viz) použití kap. arr. ke studiu dynamiky změn v buňkách infikovaných virem. Více široce používaná luminiscenční mikroskopie (viz).

Průzkumy skvrn, výtisků a jednovrstvých buněčných kultur pěstovaných na sklenicích. Přípravky (domorodé nebo pevné) jsou často zbarveny oranžovým akridinem. Metoda umožňuje detekci velkých virů a shluků virových složek. Formace obsahující DNA září s jasně zeleným světlem a ty, které obsahují RNA, jsou cihlově červené. Ještě častěji, když V. a. produkují léčbu infikovaných buněk fluorescenčními protilátkami, což umožňuje detekovat klastry virového antigenu. Přímým způsobem se používá imunitní gama globulin značený fluorescenčním barvivem, například fluorescein-isothiokyanát. Při nepřímých metodách je přípravek ošetřen obvyklým imunním sérem zvířete a pak značenými protilátkami proti gama globulinu tohoto zvířete. Přípravky jsou zkoumány v ultrafialovém světle, virový antigen je detekován světle zelenou luminescenci (viz Imunofluorescence). Metoda výtěrů z nosohltanu umožňuje včasnou diagnostiku respiračních virových infekcí - chřipky, parainfluenza, rhino- a adenovirus, respirační syncyciál.

Elektronová mikroskopie (viz) umožňuje studovat velikost a strukturu virových částic, stejně jako jemné změny způsobené těmito buňkami. Zkoumá se virové suspenze nebo ultra tenké části infikovaných buněk. Některé viry (např. Řada lidských a zvířecích onkornavirů) mohou být detekovány v tkáních pouze touto metodou.

B. a., Jejichž účel - stanovení množství (titru) viru nebo virových protilátek je velmi různorodý.

Pod elektronovým mikroskopem je možné vypočítat počet virových částic v suspenzi, pokud je dostatečně čištěn. Virus je smíchán s polystyrenovým latexem, je známo množství částic. Směs se nastříká na mřížku, počítá se počet částic v jednotlivých kapkách. Poměr počtu latexových částic a virů odhaluje počet virionů v daném objemu. Tato metoda neposkytuje představu o infekční aktivitě viru, protože virový kal obvykle obsahuje značný počet neinfekčních částic.

Nejpřesnější způsob stanovení počtu infekčních jednotek v materiálu umožňuje způsob plaků. Jednovrstvé buněčné kultury jsou infikovány malou dávkou viru. Titr je vyjádřen počtem jednotek tvořících plak (PFU) v 1 ml. Stejně tak lze stanovit titr viru nějaké onkogenní transformaci domy, stejně jako ty látky, které tvoří kráterů na chorioallantoidní membránu kuřecích embryí (např., Variola virus).

Méně přesné je stanovení virového titru metodou koncových ředění. Stejně rostoucí ředění (obvykle desetinásobně) se podává citlivému zvířeti, kuřecím embryím nebo buněčným kulturám. Vzhledem k výsledku každé injekce jako pozitivní nebo negativní určte nejnižší dávku viru, která může způsobit určitý účinek (onemocnění nebo smrt zvířete, výskyt cytopatických změn v kultuře atd.). Prakticky je tato dávka obtížně určitelná, takže vypočtete dávku s 50% účinkem (ED50). Stanoví se v závislosti na vlastnostech viru a metodě titrace pro počet mrtvých zvířat (LD50), počet případů (ID50), počet embryí, u kterých se vyvinuly virové hemaglutininy nebo antigeny vázající komplement, podle počtu buněčných kultur, kde byly detekovány cytopatické změny nebo hemadsorptivní aktivita. Titr se vyjadřuje číslem ED50 v určitém objemu materiálu.

Ze stávajících metod výpočtu ED50 se nejčastěji používá metoda Reed-Munch, založená na principu kumulace. Je založen na předpokladu, že každý testovaný objekt (myš, embryo), který pozitivně reaguje na zavedení tohoto ředění, reaguje pozitivní reakcí na zavedení koncentrovanějšího viru. A naopak, pokud toto zředění způsobilo negativní reakci, pak se zavedením většího zředění bude také negativní reakce. Intervaly mezi ředěním podle této metody by měly být stejné, každé šlechtění infikuje ne méně než 4 zvířata (kultury). Další interpolace mezi dávkami, která způsobila účinek nejblíže 50%. Výpočet se provádí podle vzorce:

kde B - nejnižší dávka, která způsobila účinku více než 50%, b - Účinek dávky v procentech, a - nejvyšší dávka účinek způsobený účinkem méně než 50%, v procentech, d - interval mezi logaritmy dvou sousedních dávek.

Viry s výraznou cytopatickou aktivitou (např. Virus polio) mohou být titrovány metodou testu barvy. Je založen na skutečnosti, že během růstu buněk je pH média sníženo a v infikovaných kulturách, kde buňky degenerují, nedochází ke změně pH média. K detekci těchto změn se do média přidá fenolický červený indikátor, který má pH více než 7 červených, při pH 7 oranžové a při pH pod 7, žluté. Fenolová červená se přidává do živného média s pH 7,3 až 7,4 při konečné koncentraci 1: 40 000. Určete minimální dávku buněk, která změní barvu média z červené na žlutou (obvykle asi 25 000 až 0,25 ml). Dále se připraví desetinásobné ředění viru, z nichž každý se nalije do 4-6 zkumavek, do kterých se přidá buněčná suspenze. Trubky jsou uzavřeny gumovými zátkami nebo se nalije 0,6-0,8 ml vazelinového oleje. Výsledky jsou vzaty v úvahu po stárnutí po dobu 5-7 dnů při t ° 37 °. Pro titr viru se zřeďte jeho ředění, čímž se zabrání změně pH na kyselou stranu v 50% zkumavek.

Schopnost imunních sér neutralizovat infekční aktivitu virů je určována neutralizační reakcí. Metody titrace sér jsou předurčeny metodami titrace odpovídajících virů. Všechny jsou založeny na přípravě směsí viru se sérem, které se pak testují na přítomnost ne-neutralizovaného viru. Reakce probíhá ve dvou verzích. V jednom z těchto imunitního a normálním séru v ředění (např. 1: 10) se smísí s rostoucí 10 ředění viru ve stejném objemu a určit titr viru v přítomnosti buď séra. Kvocient ED50 virus v přítomnosti normálního séra na jeho ED50 v přítomnosti imunitního systému bude neutralizačním indexem tohoto zředění imunního séra. Tento výsledek nelze interpolovat na jiné sérové ​​ředění (např. Aktivita nezředěného séra bude vyšší než vypočítané). Alternativně může být konstantní dávka viru (obvykle přibližně 100 ED50) se kombinuje se sérií dvojnásobných ředění testovaného séra. Sérový titr bude ředěním, přičemž virus typu to-ry způsobí 50% účinek.

V závislosti na titrační metodou neutralizace viru se reakce provádí na laboratorní zvířata kuřecích embryí (jejich ztrátou hemaglutininy nebo akumulace), v buněčných kulturách (pro vzhled cytopatického změny barvy vzorku a r. N.). Jestliže virus vytváří pockmarks na chorioalantoidní membráně kuřecích embryí, stanoví se nejvyšší zředění séra, což snižuje počet kloubů o 50 nebo více procent. Podobně se sérum titruje podle snížení počtu virových plaků na jednovrstvých buněčných kulturách.

Virová titrace RGA a HAI protilátek je založena na schopnosti řady virů (miksovirusy někteří zástupci poxviry, adenoviry, pikornavirů a Togaviridae) červené krvinky se držet pohromadě. Vírus je titrován ve dvojnásobném zředění se stejným objemem 0,5-1% suspenze erytrocytů. U titru (1 AE - aglutinační jednotka) je třeba vzít největší zředění, které způsobuje hemaglutinaci (viz.). Hemaglutinační titr viru je míra jeho infekční činnosti jako hemaglutinace) může způsobit nepřenosných „neúplných“ částice, inaktivovaný virus a oddělitelný od určitého viru hemaglutinujícího antigenu. Séra v RTGA titrovaná dvojnásobným zředěním s 2-4 AE virem; titr je považován za nejvyšší zředění a zcela inhibuje hemaglutinaci).

Některé viry jsou adsorbovány na erytrocytech, ale nezpůsobují jejich aglutinaci. Chcete-li je detekovat, můžete použít nepřímou hemaglutinační reakci. Je založen na aglutinaci "specifického pro erytrocytové" virové specifické sérum vzhledem k tomuto viru. Tato metoda se používá hlavně pro titraci séra.

Komplementární fixační reakce (viz) je vhodná pro titraci obou virů (přesněji antigen virem vázaného na komplement) a protilátek. V zásadě se RSK s viry neliší od bakteriálních a jiných antigenů. Rozdíly existují pouze při způsobu přípravy antigenů. Jako virové antigeny mohou být krev, nosohltanu výplachu, moč, stolici pacientů infikovaných kalové orgánů, částí infikovaných kuřecích embryí a kultivovány v buněčných kulturách viru. Nejvhodnější jsou kultivační antigeny. Vyloučení infikovaných orgánů před použitím opakovaně zamrazeny a rozmraženy v kombinaci se stejným objemem etheru a chloroformu, protřepou po dobu 1-2 hodin, potom se nechá stát po dobu 18-20 hodin. při t ° 4 °, znovu zmrazit, rozmrazit a vyjasnit odstředěním. K získání séra by zvířata neměla být imunizována virem, který je kultivován ve stejném substrátu jako antigen pro reakci. V závislosti na účelu titrace se kombinují dvojité ředění antigenu s určitou dávkou séra nebo naopak dvojnásobné ředění séra s jednou dávkou antigenu. Kontakt antigenu, séra a komplementu se provádí po dobu 1 hodiny při t ° 37 ° nebo 18 hodinách. při t ° 4-6 °. Po přidání hemosystému se materiál inkubuje 30 minut. při t ° 37 °. Výsledky jsou vyhodnocovány podle obecných pravidel.

Existují metody pro titrování virů a protilátek na základě indikace viru v infikovaných kultivačních buňkách fluorescenčními protilátkami, stejně jako řada dalších, které se používají zřídka.

Toxický účinek inherentní na určité viry se zjistí podáváním velkých dávek zvířat neobvyklým způsobem, při kterém virus neobsahuje úplný cyklus reprodukce. Například virus chřipky se podává myším v mozku nebo intravenózně. O jeho toxickém účinku se posuzuje smrt zvířat během prvního dne.

Antigenní aktivita viru (nebo vakcíny) se stanoví imunizací lidí nebo zvířat a poté stanovením titru protilátek v jejich séru. Imunogenní aktivita vakcíny, tj. Schopnost vyvolat odolnost vůči infekci, se stanoví imunizací zvířat vnímavých k viru. Poté se imunizovaná zvířata a kontrolní neimunizované infikují řadou zředění viru, přičemž se stanoví jejich ED50 pro obě skupiny. Rozdíl v získaných indexech charakterizuje imunogenicitu testovaného léčiva. Pokud není virus pro zvířata patogenní, může být imunogenita příslušné vakcíny stanovena pouze v epidemiolu. zkušeností.

Pro studium vlastností řady virů (velikost, struktura, chemické, končící i m. P.) Musí být čistého materiálu s vysokým titrem. Nejčastěji používaný virus se pěstuje v buněčných kulturách nebo ve formě alantoidní tekutiny infikovaných kuřat embryí. Čištění se obvykle začít s diferenciálním odstředěním, nejprve na 15-20 tisíc g (g- gravitační zrychlení) uvolňovacího materiálu z buněčné drti, a na 50-100 tisíc g - vysráží samotného viru... Pro uvolňování velkých částic se filtrace používá také pomocí těsnění z azbestu (typ Zeitz), skleněných a celulózových membránových filtrů (jako je millipore). Fragmenty, které jsou menší než viry, lze odstranit filtrováním materiálu pomocí sefadex-gelů, které v závislosti na velikosti pórů zadržují částice určité velikosti. Pro izolaci a koncentraci viru z velkých objemů, vysolení pomocí síranu amonného a sodíku se používá srážení alkoholem, hydroxidem hlinitým nebo polyethylenglykolem. K uvolnění z balastních bílkovin se také používá jejich trávení proteolytickými enzymy. Miksoviry mohou být purifikovány a koncentrovány adsorpcí na erytrocytech při nízké teplotě s elucí při vyšší teplotě.

Další čištění a koncentrace viru se provádí tímto nebo tímto způsobem frakcionace. Tyto metody se také používají k oddělení mutantních virů a jednotlivých virových složek. Při míchání virus s fázovým systému tvořeného vodných roztocích dvou polymerů, přejde do jedné z fází v závislosti na jejich velikosti, iontová složení média, pH a podobně, pro čištění velkých viry obvykle používají dextran. - methylcelulosa, malý - dextransulfát s polyethylenglykolem. Polymery, které zůstávají po separaci fází, se často odstraňují během dalšího čištění viru. Je také možné, aby se odstranil chlorid draselný přidáním dextransulfátu, methylcelulóza pomocí síranu amonného, ​​polyethylenglykol chloroform a jiné metody.

Virus Přečištěním sloupcovou chromatografií na základě jejich schopnosti být adsorbována na řadu látek, a eluuje se z nich (viz. Chromatografie) s měnící se koncentrací pH nebo soli. Používá se pro adsorpci fosforečnanu vápenatého, gelů, iontoměniče na bázi celulózy (obvykle aniontoměniče, například DEAE) iontoměničová pryskyřice. Eluce viru se provádí s fosforečnan vápenatý tlumivých roztoků o vzrůstající koncentraci a s iontoměničem na bázi celulózy - roztoků chloridu sodného.

Vysoce čisté suspenze se získají odstředěním v kapalné koloně s hustotou distribuovanou v kontinuálním gradientu. Virové částice se shromažďují na úrovni, kde je hustota média rovna jejich hustotě vztlaku. Zónové centrifugace v gradientu sacharózy umožňuje oddělení částic různými hmotami. Materiál se aplikuje na gradient vytvořený vrstvením odpovídajících roztoků sacharózy. Na konci odstředění se shromáždí frakce, které propichují dno zkumavky. Při rovnovážném nebo isopynickém odstředění jsou částice viru suspendovány v roztoku chloridu cesného, ​​síranu cesného nebo chloridu rubidia. Po delším odstředění se vytvoří stabilní gradient kontinuální hustoty roztoku. Na místě viru mohou částice určit jejich hustotu. Je třeba poznamenat, že získané hodnoty hustoty a hmotnosti virových částic do jisté míry závisí na médiu použitém při odstředění.

Když V. a. Víry označené různými radioaktivními izotopy jsou široce používány. Nejčastěji používaný uhlík 14 C, tritium 3 H, fosfor 32 P, síra 35 S, jód 131 I. Nejsnazší je označit virus, když je kultivován v buněčných kulturách. Radioaktivita se stanoví pomocí čítače tekutých scintilací nebo autorádiografií (viz).

Chem. složení virů je zkoumáno konvenční chemikou. metody. Nukleová kyselina se obvykle získává fenolovou extrakcí a méně často se používají aniontové detergenty, dodecyl nebo laurylsulfát sodný.

K identifikaci virů (viz) je nejprve nutné vytvořit jejich obecné příslušenství. K tomu je nutné určit velikost a strukturu virové částice tvoří v nich nukleovou-ti, přítomnost lipoidní pláště. Typ nukleové kyseliny je nejčastěji určován nepřímými metodami, například použitím schopnosti bromdeoxyuridinu inhibovat proliferaci virů obsahujících DNA. Přítomnost lipoidního povlaku ve viru je potvrzena jeho citlivostí na působení etheru a chloroformu (obalené viry jsou inaktivovány). Další identifikace se provádí se souborem antisér se známými viry pomocí různé reakce -. Neutralizovat DGC, HI, atd. Méně imunizovaná zvířata produkují známý virus se dále neznámým kontaminace nebo naopak.

Bibliografie: Laboratorní diagnostika virových a rickettsiálních onemocnění, ed. E. Lennet a N. Schmidt, str. s angličtinou., M., 1974, bibliograf.; Luria G. Ye. A Darynl JE, General virology, trans. s angličtinou., M., 1970, bibliograf.; Metody virologie a molekulární biologie, trans. s angličtinou., M., 1972; VA Shchennikov-Sh., Semenov BF iZeze-р о в Е. Г. / Standardizace metod virologického výzkumu, M., 1974, bibliograf.; Příručka pro laboratorní diagnostiku virových a rickettsiálních onemocnění, ed. PF Zdrodovský a MI Sokolov, M., 1965; Sokolov MI, Sinitskii AA a Remezov PI Virologické a serologické studie virových infekcí, L., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.

Metody vyšetřování virů

Významné vlastnosti metod pro studium virů. Podstata, význam a aplikace elektronické a imunoelektronické mikroskopie, specifičnost metody imunofluorescence. Popis metody molekulární hybridizace. Schéma elektronového mikroskopu.

Posílání dobré práce do znalostní základny je snadné. Použijte níže uvedený formulář

Studenti, postgraduální studenti, mladí vědci, kteří používají znalostní bázi při studiu a práci, vám budou velmi vděční.

Hosted on http://www.allbest.ru/

Ministerstvo školství a vědy Ruské federace

Federální státní rozpočet Vzdělávací instituce vyššího odborného vzdělávání

Fakulta přírodních věd

Katedra botaniky a genetiky

Metody vyšetřování virů

Dokončeno: Evteeva D.S.

METODY PROVÁDĚNÍ VÍRUSŮ

ELEKTRONICKÁ MIKROSKOPIE VIRŮ

METODA MOLEKULÁRNÍ HYBRIDIZACE

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

Viry jako povinné intracelulární parazity nemohou růst na umělém živném médiu. Mohou se množit pouze v organizmech vnímavých hostitelů nebo v živých buňkách, které jsou vůči viru citlivé.

Organizmus receptivního hostitele pro studium virů se používá v těch případech, kdy neexistují experimentální systémy pro studium patogeneze virových infekcí, při testování bezpečnosti virových vakcín nebo specifické neškodnosti virových drogy. Vedle zjevných výhod mají tyto metody nevýhody a omezení týkající se obtíží standardizace a reprodukovatelnosti výsledků a také kvůli poměrně vysokým nákladům na experimenty.

Buněčné kultury, zavedené do výzkumné praxe ve čtyřicátých letech minulého století, radikálně změnily metodologický arzenál virologie.

V současné době jsou v experimentální a praktické virologii zásadní kulturní metody.

Výzkumné metody používané v virologii se značně liší složitostí, což je primárně způsobeno absolutním intracelulárním parazitismem virů a jejich malou velikostí.

METODY PROVÁDĚNÍ VÍRUSŮ

Výzkumné metody používané v virologii se značně liší složitostí, což je primárně způsobeno absolutním intracelulárním parazitismem virů a jejich malou velikostí.

Při studiu materiálů získaných od pacientů s virovými infekcemi se pro laboratorní diagnostiku těchto onemocnění používají různé metody:

· Metody elektronové a imunoelektronové mikroskopie;

· Metoda molekulární hybridizace;

· Metoda imunofluorescence;

· Identifikace protilátek třídy lgM.

ELEKTRONICKÁ MIKROSCOPIE

Elektronová mikroskopie je metoda studia struktur, které jsou mimo hranice viditelnosti světelného mikroskopu a mají rozměry menší než jeden mikron (od 1 mikronů do 1-5 A).
Akční elektronový mikroskop (Pril.1.ris.1) je založena na využití směrového elektronového toku, který slouží jako světelný paprsek ve světelném mikroskopu, a role, kterou hraje čočky magnety (magnetické čočky).

Vzhledem k tomu, že různé části zkoumaného objektu zadržují elektrony různými způsoby, je na obrazovce elektronového mikroskopu získán černobílý obraz studovaného předmětu, zvětšený o desítky a stovky tisíckrát. V biologii a medicíně se používají především elektronové mikroskopy průsvitného typu.

Elektronová mikroskopie vznikla ve 30. letech minulého století, kdy byly získány první snímky některých virů (virus mozaiky tabáku a bakteriofágy). V současné době elektronová mikroskopie nalezla nejširší uplatnění v oblasti cytologie, mikrobiologie a virologie, což způsobilo vznik nových odvětví vědy. S elektronickou mikroskopií biologických objektů se používají speciální metody přípravy. To je nezbytné pro identifikaci jednotlivých složek sledovaných objektů (viru) a pro zachování jejich struktury za vysokého vakua pod elektronovým svazkem.

Pomocí elektronové mikroskopie se zkoumá vnější forma objektu, molekulární uspořádání jeho povrchu, pomocí metody ultratenkých úseků se zkoumá vnitřní struktura objektu.

Elektronová mikroskopie v kombinaci s biochemickými, cytochemickými metody výzkumu, imunofluorescence, a rentgenové analýzy poskytuje pohled na složení a funkce konstrukčních prvků buněk a virů.

Elektronová mikroskopie virů zafarbených metodou negativního kontrastu umožňuje diferenciaci virů a určení jejich koncentrace. Použití elektronové mikroskopie při diagnostice virových infekcí je omezeno na případy, kdy je koncentrace virových částic v klinickém materiálu dostatečně vysoká (105 v 1 ml nebo více).

Nevýhodou metody je neschopnost rozlišovat mezi viry patřícími do stejné taxonomické skupiny. Tento nedostatek se eliminuje použitím imunní elektronové mikroskopie.

Metoda je založena na tvorbě imunitních komplexů, když se specifické sérum přidává k virovým částicím, zatímco současná koncentrace virových částic umožňuje jejich identifikaci. Tato metoda se také používá k detekci protilátek. Pro účely expresní diagnostiky se provádí elektronomikroskopické vyšetření extraktů tkání, výkalů, tekutiny z vezikul, tajemství z nosohltanu.

Elektronová mikroskopie se široce používá ke studiu morfogeneze viru, jeho možnosti jsou rozšířeny použitím značených protilátek.

IMUNEELECTRONICKÁ MIKROSCOPIE

Jedná se o přímou vizualizaci interakce antigenu a protilátek elektronovou mikroskopií, nejprve byla navržena pro virologické studie J. Almeidy a A. Watersona v roce 1969.

Metodicky se test IEM provádí v následujícím pořadí:

1. Materiál, u kterého je podezření na požadovaný virus, je smícháno a inkubováno se standardním imunním sérem;

2. Komplex virus-protilátka se vysráží centrifugací ve vhodných režimech;

3. Do resuspendovaného sedimentu se přidá kontrastní činidlo a výsledný přípravek se zkoumá pod elektronovým mikroskopem.

V případě pozitivní reakce se objevují charakteristické agregáty sestávající z virových částic spojených mosty protilátek. Prah citlivosti IEM je nízký: spolehlivá detekce viru je možná, jestliže jeho koncentrace ve výchozím materiálu činí 10 ^ 4-106 částic / ml.

Výhodou metody je schopnost vyhodnotit nejen výsledek sérologické reakce, ale také identifikovat její morfologický substrát, tj. Určit tvar a velikost virových částic. V přítomnosti přípravků viru se známým obsahem částic lze IEM použít pro kvantitativní stanovení protilátek v séru, pro které je navržen speciální systém pro zaznamenání intenzity interakce viru a protilátek.

Sérologické metody v Virology na základě klasických imunologické reakce: Reakce fixaci komplementu, hemaglutinační inhibice, biologické neutralizace, imunodifúzní, nepřímé hemaglutinace, radiální hemolýze, imunofluorescenci, enzymového imunologického testu, radioimunoanalýzu. Byly vyvinuty mikrometody mnoha reakcí, jejichž technika se neustále zlepšuje.

Tyto metody se používají k identifikaci virů pomocí známých sadu séra pro serodiagnosis a stanovit růst protilátky v druhém séru ve srovnání s prvním (první séru odebraném po prvních několika dnech nemoci, druhý -. Po dobu 2-3 týdnů). Diagnostická hodnota není menší než čtyřnásobné zvýšení protilátek v druhém séru. Pokud detekce IgG protilátek naznačuje nedávnou infekci, pak protilátky IgG přetrvávají několik let a někdy po celý život. K identifikaci jednotlivých antigenů virů a protilátek proti nim v komplexních směsích bez předběžného čištění proteinů použijte imunoblotování.

Metoda kombinuje frakcionaci proteinů elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a následně immunoindikatsiey proteinů pomocí ELISA. Separace proteinů snižuje požadavky na chemickou čistotu antigenu a umožňuje identifikaci jednotlivých párů antigen-protilátky. Tento problém je důležitý, jako je serodiagnosis HIV, kde falešně pozitivní reakce imunologického testu v důsledku přítomnosti protilátek proti buněčné antigeny, které jsou přítomny v důsledku nedostatečného čištění virových proteinů.

Identifikace protilátek v séru pacientů na vnitřní a vnější virové antigeny umožňuje určit stádium onemocnění a při analýze populací - variabilitu virových proteinů.

Imunoblotting u infekce HIV se používá jako potvrzovací test pro detekci jednotlivých virových antigenů a protilátek proti nim. Při analýze populací se metoda používá pro stanovení variability virových proteinů.

Velkou hodnotou metody spočívá v možnosti analýzy antigenů syntetizovaných technologií rekombinantní DNA, stanovení jejich velikosti a přítomnosti antigenních determinant.

virus molekulární hybridizační mikroskop

Imunofluorescenční techniku ​​nebo imunofluorescence (RIF), který se používá v mikrobiologických laboratořích vybavených fluorescenčním mikroskopem.

Ve studii jsou použity přímé a nepřímé imunofluorescenční reakce.

Pokud se pro diagnostiku použije přímá reakce imunofluorescence, na sklíčko se aplikuje klinický materiál fixovaný ethanolem.

Poté se přidá luminiscenční sérum. Proveďte vyšetření léku pod luminiscenčním mikroskopem.

Imunologická reakce antigen-protilátky probíhá přímo na snímku. Například antigen chřipky, který je spojen se značenou imunoglobulinu, pod mikroskopem má formu jasných žhavých částic rozmístěných v jádru a cytoplazmě infikovaných buněk. Metoda je jednoduchá, ale vyžaduje luminiscenční séra pro každý typ antigenu.

Podstata nepřímé reakce imunofluorescence spočívá v tom, že antigen vázaný na sklíčko se naváže na specifické (neznačené) sérum. Luminiscenční sérum se přidává do komplexu antigen-protilátka vytvořeného na skle.

Posledním krokem je mikroskopie, která identifikuje označené komplexy.

Tato metoda spotřebovává malé množství luminiscenčních sér, takže je široce používána k detekci bakteriálních, rickettsiálních, pneumocystisových infekcí.

Umožňuje snadno identifikovat chřipkové viry, parainfluenzy, adenoviry, respirační syncyciální virus, cytomegalovirus. Diagnóza legionelové a chlamydiové infekce by se měla také provést imunofluorescenční reakcí za účelem stanovení vhodného antigenu.

METODA MOLEKULÁRNÍ HYBRIDIZACE

Metoda molekulární hybridizace založená na detekci nukleových kyselin specifických pro viry umožňuje detekovat jednotlivé kopie genů a je bezkonkurenční stupněm citlivosti.

Reakce je založena na hybridizaci komplementárních řetězců DNA nebo RNA (sondy) a na tvorbě dvouvláknových struktur. Nejlevnější sondou je klonovaná rekombinantní DNA. Sonda je označena radioaktivními prekurzory (obvykle radioaktivním fosforem). Perspektivní využití kolorimetrických reakcí.

Existuje několik variant molekulární hybridizace: bodová, blotová hybridizace, sendvičová hybridizace, in situ hybridizace atd.

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

1) Laboratorní diagnostika virových infekcí, N.N. Nosik, V.M. Stakhanova

2) Ústav virologie. D. A. Ivanovský RAMS, Moskvě ; Laboratoř Diagnóza z Vírusová Infekce, N.N. Nosik, V.M. Stachanova

3) Atlas anatomie a ontogeneze lidských a zvířecích virů, AA Avakyan, AF Bykovskii, 1970

4) Planeta virů, Carl Zimmer, 2012

5) http://www.serdechno.ru/enciklopediya/3171.html