Amplisense hcv fl

Symptomy

K letním teplotám v jezerech, parcích a náměstích aktivní hlinky. Tom, perebuivaychi na přírodě, varto pourbuvatisya o vlasnu bezpeku, abi.

03/01/2017

test AmniSure

Koupit test pro stanovení úniku plodové vody v těhotenství Amnishur můžete také v lékárnách v Kyjevě:
1. Lékárny "Arnika".

26.2.2016

FLOROKENÓZA

Komplexní test nové generace pro diagnostiku ALL klinicky významných infekcí urogenitálního traktu u žen v reprodukčním věku..

POKYNY. "AmpliSens HCV genotyp-FL" AmpliSens

loading...

Přepis

loading...

1 instrukce pro použití kitu reagencií pro detekci a diferenciaci genotypů hepatitidy C (HCV) v klinických vzorcích pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s detekcí hybridizace-fluorescence v „reálném čase“ režimu „AmpliSens HCV genotyp-FL» AmpliSens Federální rozpočet instituce science "Central Research Institute of epidemiology", Ruská federace, Moskva, ulice Novogireevskaya 3a dům

2 OBSAH SEZNAM AKRONYMŮ. 3 ÚČEL. 3 PRINCIP METODY. 3 FORMÁTY A FORMY VYDÁNÍ SADY REAGENCIÍ. 5 ANALYTICKÉ CHARAKTERISTIKY. 5 BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ. 6 DODATEČNÉ MATERIÁLY A ZAŘÍZENÍ. 7 TAKE, doprava a skladování zkušebního materiálu. 9 Složení ASPECT FRT PCR RNA extrakcí z STUDIE vzorku USPOŘÁDÁNÍ reakce reverzní transkripce A. Příprava trubek pro reverzní transkripce B. provádění reakce reverzní transkripce amplifikace s detekcí v „reálném čase“ od A. Příprava trubek A1 pro amplifikaci. Příprava zkušebních zkumavek pro amplifikaci s použitím sady „PCR kitu“ činidla varianta FRT-G A2. Příprava zkušebních zkumavek pro amplifikaci pomocí reagenciemi soupravy „PCR kit“ varianta FRT-G B. vodivého detekci amplifikace v „reálném čase“ analýza a interpretace výsledků SKLADOVATELNOST, dopravní a skladovací podmínky DODATEK 1. Extrakce RNA pomocí kitu reagencií " ribo-Sorb "PŘÍLOHA 2. RNA extrakcí reakční sestavě" ribo-prep „symboly v tiskoviny x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / s. 2 32

3 Zkratky následující zkratky a symboly použité v tomto návodu: DNA dezoksirubonukleinovaya cDNA kyseliny komplementární DNA, RNA, ribonukleové kyseliny z reverzní transkripci EKO vzorku vnitřní kontroly OKO negativní kontrola PKO pozitivní kontrola K + - pozitivní kontrola PCR K - negativní kontrolní PCR OK - negativní PCR kontrola extrakce polymerázové řetězové reakce FBUN centrální výzkumného ústavu epidemiologie HCV FRT ÚČEL federálního rozpočtu stanovena ix Science „Ústřední výzkumný ústav pro epidemiologii“ Federální služba pro dohled nad ochranu spotřebitele práv a dobrých životních podmínek v hepatitidy C detekci viru fluorescence v „reálném čase“ Reagenty „AmpliSens HCV-genotyp-FL“ je určen pro detekci a diferenciaci virů genotypů hepatitidy C (HCV) v klinických vzorcích pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s detekcí hybridizace-fluorescence v „reálném čase“. Stanovení HCV genotypů 1A, 1B, 2, 3a, 4 se provádí pomocí "PCR kitu" varianta FRT-g1-4; určení genotypy HCV 1A, 1B, 2, 3a, 4, 5a, 6 se provádí pomocí "PCR kitu" varianta FRT-g1-6. Toto činidlo souprava se doporučuje používat po detekci HCV RNA ve vzorcích s použitím soupravy určené pro kvalitativní a kvantitativní stanovení HCV RNA (např., „AmpliSens HCV-FL», pomocí detekce gibridizatsionnofluorestsentnuyu, nebo „AmpliSens HCV erh „pomocí elektroforetickou detekci amplifikačních produktů (vyrobeno FBUN Epidemiology CRI)). POZOR! Výsledky PCR analýzy jsou uvedeny v komplexní diagnóza onemocnění 1. Princip metody 1 V souladu se směrnicí EU 98/79 / ES. 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / s. 3 z 32

4 je založen na principu testování extrakci RNA z krevní plazmy spolu s rekombinantním vnitřní kontrolní vzorek (ASD), prováděním RNA reakce reverzní transkripce a PCR amplifikace detekce cDNA gibridizatsionnofluorestsentnoy v „reálném čase“. S cílem vyloučit falešně negativní výsledky v této studii vstoupil EKR, který vám umožní ovládat všechny fáze analýzy a vyhodnocení vlivu inhibitorů PCR o výsledcích studie. Stanovení genotypu HCV jednoho vzorku se koná ve více trubek, každou zkumavku ve dvou diferencované genotypu HCV, nebo jeden genotyp a HCV EKO. Sada je určena pro přístroje s dvěma nebo více kanály fluorescenční detekce. V tabulce jsou uvedeny kanály, které detekují HCV genotypy pro každou reakční směs. Reakční směs 1b / 3a 1A / 2/4 EKR 5a / 6 genotypy 2 kanálu detekovatelné HCV FAM / zelená 1b 1a ASD 5a JOE / Hex / žlutá / Cy3 3a je součástí "PCR kitu" varianta FRT-g1-6. 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / s. 4 z 32

5 FORMÁT A VÝFUKOVÝCH KIT reagencií soupravy Reagent vyrobeného v jednom formátu: Formát soupravy FRT Reagent vyráběny v 7 formách nastavit: Forma 1 obsahuje reagenční soupravy "ribo-Sorb" varianta 50 „Reverte-L» volby 50, "PCR kit" možnost FRT-g1-4. Forma 2 obsahuje reagenční soupravy "ribo-prep" variantní 50 „Reverte-L» volby 50, "PCR kit" varianta FRT-g1-4. Formulář 3 obsahuje sadu činidel "sadu PCR" FRT-g1-4. Formulář 4 zahrnuje kity reagencií "ribo-Sorb" varianta 50 „Reverte-L» volba 50, "PCR kit" varianta FRT-g1-6. Formulář 5 zahrnuje kity reagencií "ribo-prep" varianta 50 „Reverte-L» volba 50, "PCR kit" varianta FRT-g1-6. Formulář 6 obsahuje sadu činidel "sadu PCR", která je součástí FRT-g1-6. Formulář 7 obsahuje reagenční soupravy hromadně, v balení pro individuální činidel, značená činidla na jejich velkoobchodní balení. Tvar konfigurace 1, 2, 3 jsou určeny pro stanovení genotypu 1a, 1b, 2, 3a, 4 C. formy HBV sestavy 4, 5, 6 jsou určeny pro stanovení genotypu 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a, 6 HCV C. tvoří sestava 1, 2, 4, 5 jsou určeny k provádění komplexní PTsRissledovaniya včetně extrakce RNA z klinického materiálu, provádí reverzní transkripci RNA a PCR amplifikace detekce cDNA gibridizatsionnofluorestsentnoy v „reálném čase“. Tvoří kompletní sadu 3 a 6 se používají pro PCR amplifikaci cDNA detekce hybridizace-fluorescence v „reálném čase“. Chcete-li provést úplnou analýzu je nutné použít kitů reagencií FBUN Výroba Výzkumný ústav epidemiologie pro extrakci RNA (kitů reagencií „ribo-Sorb“ nebo „ribo-prep“), a reakce reverzní transkripce (soupravě „Reverte-L»). Kompletní Form 7 je určen pro průmyslové účely pro následné značení v jazyce zákazníka a kompletní sadu souborů. POZOR! Použitím 7, tvoří kompletní sadu pouze v souladu s pravidly schválenými FBUN Centrální Výzkumného ústavu epidemiologie. ANALYTICKÉ HARAKTISTIKI 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / s. 5 z 32

6 Analytická extrakce citlivost Objem, l Souprava pro extrakci RNA / DNA 100 "ribo-Sorb" 100 "ribo-prep" sada pro amplifikaci a detekci "PCR kit" varianta FRT-g1-4, «PCR kit“ provedení, FRT- g1-6 «PCR kit“ varianta FRT-g1-4, «PCR kit“ varianta FRT-g1-6 analytická citlivost, IU / ml 5x10 3 2,5x10 3 analytické hodnocení specifičnost analytické činidlo souprava specifičnost nevykazovaly zkříženou reakci mezi genotypy 1A, 1B, 2, 3a, 4, 5a a 6 virem hepatitidy C s použitím vysoce rekombinace UPOZORNĚNÍ práce musí být prováděny v laboratorním provedení molekulyarnobiologicheskie (PCR) studie klinických vzorků na přítomnost infekčních agens, v souladu s sanitární-epidemiologické pravidla SP „bezpečnosti práce s mikroorganismy III IV patogenitu skupin (nebezpečí) a aktivátorů parazitárních nemocí“, SanPin „sanitární epidemiologické požadavky na řízení biologického odpadu „a pokyny MU“ organizace laboratoří s využitím metod amplifikace n V provozu vždy splňovat následující požadavky: - Je třeba považovat za zkušebních vzorků infekčních a nebezpečnou práci pro organizaci a skladování v souladu s SP „bezpečnosti práce s mikroorganismy III IV patogenitu skupin (nebezpečí) a parazitární onemocnění látek.“ - K čištění a dezinfekci lahvových vzorků nebo reakčních činidel pomocí dezinfekčních prostředků v souladu s SP „bezpečnosti práce s mikroorganismy III IV patogenitu skupin (nebezpečí) a parazitární onemocnění látek.“ - Laboratorní proces musí být jednosměrný. Analýza se provádí v 2 (RG, iQ, Mx, dt, SC) / VER / str. 6 z 32

7 samostatných pokojů (zón). Práce by měla začít v zóně přidělování, pokračovat v zóně zesílení a detekce. Nevrací vzorky, zařízení a materiály, v oblasti, ve které se tento proces provádí předchozí krok. - Odebrání nepoužívaných činidel v souladu s SanPiN „Hygienické požadavky na řízení biologického odpadu.“ POZOR! Při odstraňování odpadu po amplifikaci (zkumavek, které obsahují PCR produkty) nepřípustné otevření trubek a stříkající obsah, protože to může vést ke kontaminaci PCR produkty laboratorní oblast, zařízení a reagencií. Přístroj používejte výhradně k určenému účelu podle tohoto návodu. Umožňuje práci se sadou pouze autorizovaný personál. Sadu nepoužívejte po uplynutí doby použitelnosti. Používejte rukavice na jedno použití, laboratorní pláště, ochranné brýle při práci se vzorky a činidla. Po dokončení práce důkladně umyjte ruce. Zabraňte kontaktu s pokožkou, očima a sliznicemi. Pokud dojde k kontaktu, okamžitě opláchněte postiženou oblast vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. Bezpečnostní listy (bezpečnostní listy bezpečnostních listů MSDS) jsou k dispozici na vyžádání. DALŠÍ MATERIÁLY A ZAŘÍZENÍ OBLAST 1. Extrakce RNA z klinického materiálu 1. sady činidel pro RNA / DNA „ribo-Sorb“ (N) „ribo prep“ (TU), nebo jiný doporučená FBUN CRI epidemiologie při práci s kompletní formy 3, Laminární box. 3. Vortex. 4. Mikrocentrifuga pro testovací zkumavky "Eppendorf" až do 12 tisíc g. 5. Termostat pro trubky, jako je „Eppendorf“ od 25 do 100 ° C 6. Automaty o variabilním objemu (5 až 50 ul, 20 mikrolitrech do 200 a od 100 do 1000 litrů). 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / str. 7, 32

7. Jednorázové polypropylenové šroubové těsnění nebo těsně uzavřené zkumavky o objemu 1,5 ml. 8. Jednorázové hroty s filtrem do 100 μl, do 200 μl a do 1000 μl ve stativích. 9. Vakuové odsávací zařízení se zachycovačem pro odstranění supernatantu. 10. Jednorázové hroty až do 200 μl ve stativu. 11. Stativy pro trubky o objemu 1,5 ml. 12. Chladnička od 2 do 8 C. 13. Samostatné rukavice, klobouky, boty a jednorázové rukavice podle MU. Kapacita s dezinfekčním roztokem. OBLAST 2. Provedení reakce reverzní transkripce a amplifikace v „reálném čase“ 1 Sada činidel pro provedení reakce reverzní transkripce „Reverte-L» (W) během provozu tvoří kompletní 3, Box nebakteriální vzduch prostředí (PCR-box). 3. Centrifugujte / vír. 4. Automatické dávkovač s proměnlivým objemem (od 5 do 50 μl a od 20 do 200 μl). 5. Jednorázové špičky s filtrem do 100 μl a do 200 μl ve stativích. 6. Stativy pro 0,5 ml nebo 0,2 ml nebo 0,1 ml zkumavky (podle typu použitého tubusu). 7. Chladnička se 2 až 8 C mraznička není vyšší než mínus 16 ° C 8. Samostatný šat, čepice, boty, rukavice na jedno použití kapacity MU resetuje terminálů. Při provádění reakce reverzní transkripce pomocí „Reverte-L»: 10. Jednorázové polypropylenových zkumavek 0,2 ml nebo 0,5 ml (v závislosti na použitém modelu termocykleru nebo termostatu, ve kterém je reakce reverzní transkripce prováděného). 11. Termostat pro trubky, jako je "Eppendorf" od 25 do 100 ° C, nebo programovatelného termocykleru (např., "Tertsik" ( "DNA Technology", Rusko), Gradient Palm Cycler (Corbett Research, Austrálie), GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, USA)). 12. Při nastavení reverzní transkripční reakce pro méně než 10 vyšetřených 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 8 z 32

9 vzorků automatického dávkovacího zařízení s proměnlivým objemem (0,5 až 10 μl). 13. Při stanovení reakce reverzní transkripce, aby méně než 10 vzorků na jedno použití špičky s filtrem 10 ul stativu. Při práci s "PCR kitu": 14. Programovatelný termocykler rotačního typu (např., Rotor-Gene 3000, nebo 6000 (Corbett Research, Austrálie), Rotor-Gene Q (Qiagen, Německo)), nebo termocykleru tablety typu (např., ICycler iq5 (Bio-Rad, USA)), nebo amplifikovatelný SmartCycler II (Cepheid, USA), nebo Mx3000P, Mx3005P (Stratagene, USA) a doporučená FBUN Výzkumný ústav epidemiologie v pokynech pro použití této soupravy reagencií). 15. Jednorázové polypropylenové zkumavky pro PCR: a) tenkostěnné PCR zkumavky s uzávěrem (konvexní nestripovannye nebo stripovannye) za použití tablet zařízení typu 0,2 ml; b) tenkostěnné PCR zkumavky s plochým víkem (nestripovannye) nebo objem stripovannye trubkami 0,1 ml za použití rotačního zařízení typu 0,2 ml. c) objem PCR zkumavky 0,025 ml (Cepheid, USA) za použití zařízení SmartCycler II (Cepheid, USA). 16. Značený stativ (při použití plochých nástrojů). 17. Jednorázové polypropylenové zkumavky pro PCR (plochý uzávěr, nestripovannye), 0,5 ml 18 odstředivky a stojan pro trubky (Cepheid, USA) za použití SmartCycler II (Cepheid, USA). Odběr vzorků, přeprava a skladování testovaného materiálu před zahájením prací by měl být seznámen s pokyny ‚vzít, dopravu, skladování klinickém materiálu pro PTsRdiagnostiki„vyvinutého FSIS Crie Rospotrebnadzor, Moskva, 2008 Pro studie PCR periferní krevní plazmy. Pro krevní plazma odebraná do zkumavky s roztokem 3% EDTA rychlosti 20: 1 (20 dílů krve na 1 díl EDTA). Uzavřená zkumavka s krví je několikrát otočena. Během 6 hodin od okamžiku odběru krve se musí plazma odebrat a převést do nové zkumavky. Pro tento účel se zkumavka s krví se centrifuguje 20 minut při g, načež se plazma oddělí a přenese se do oddělení na jedno použití 2x (RG, IQ, Mx, dt, SC) / VER / str. 9 z 32

10 zkumavky. Plazma může být skladována nejvýše 3 dny při teplotě 2 až 8 ° C a po dlouhou dobu při teplotě nejvýše -80 ° C. (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 10 z 32

11Formát sada FRT FORMAT FRT SLOŽENÍ Reagent „ribo-Sorb“ volba 50 Reakční sestava pro extrakci RNA / DNA z klinického materiálu zahrnuje: reagenční Popis objem, ml roztoku Max Lysing Roztok pro mytí jedno řešení pro mytí 3 Roztok pro praní 5 1 lahvička s rozšířeným hrdlem 50 1 lahvička 20 leden lahvička sorbent suspenze bílé tampon 1,25 1 RNA 0.5 pufru trubky 5 Reakční sestava určena pro izolaci RNA / DNA z 50 vzorků, včetně kontrol. V sestavě formy 1 a 4. Reagent kit „ribo-prep“ volba 50 Reakční sestava pro extrakci RNA / DNA z klinického materiálu zahrnuje: reagenční Popis Hlasitost, ml Max lyzačního roztoku pro vysrážení roztoku na mytí řešení pro 3 RNA promývací pufr 4 transparentní modré léková lahev leden 20 leden 25 1 lahvička s rozšířeným hrdlem 10 1,2 4 zkumavky Reakční sestava určena pro izolaci RNA / DNA z 50 vzorků, včetně kontrol. V sestavě formy 2 a 5. soupravě „Reverte-L» 50 provedení kitu reagencií, pokud jsou uloženy na roztok 3 lyzačním, lyzační roztok a pro čištění 1 při teplotě od 2 do 8 ° C se může vysrážet ve formě krystalů. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 11 z 32

12 Format FRT cDNA na RNA templátu zahrnuje: RT-G-mix-1 reverzní transkriptázy RT-Mix (MMLV) DNA pufru činidla Popis objem, ml Max 0,01 0,125 5 trubky 5 0,03 trubky 1 zkumavky 1, 2 1 testovací zkumavka Reagenční sada 50 je určena pro 60 reverzních transkripčních reakcí včetně kontrol. soupravě "PCR kit" varianta FRT-g1-4 činidlo souprava pro PCR amplifikaci cDNA genotypů (1a, 1b, 2, 3a, 4), HCV s detekcí gibridizatsionnofluorestsentnoy v "reálném čase" zahrnuje: PCR směs-1- FRT genotypů HCV 1b / 3a PCR mix-1-FRT HCV genotypy 1a / 2 PCR mix-1-FRT HCV EKR / genotyp 4 činidla Popis objem, ml Počet RT-PCR směs-2-FEP / FRT polymerázy (TaqF) FFP cDNA genotypů HCV 1b / 3a FFP cDNA HCV genotypy 1A / 2 FFP HCV cDNA EKR / 4 genotyp TE pufru trubky 0,6 1 0,6 0,6 1 1 trubka trubka trubka 3 0,3 0,03 3 tuby 0,2 1 tuba 0,2 1 tuba 0,2 1 tuba 0,5 1 tuba K Sada reagencií je určena pro 55 testů (165 amplifikačních reakcí), včetně kontrol. V sestavě tvoří 1, 2 a 3. Sada činidel připojených kontrolních vzorků extrakčního stupně :. 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 12 32

13 FORMAT FRT Popis Hlasitost činidlo, ml Max OKO EKR STI-248-rec trubice soupravě 1 tuba 0,5 0,5 1 varianta FRT-g1-6 reagenční soupravy "PCR kit" pro PCR amplifikaci cDNA genotypů ( 1A, 1B, 2, 3a, 4, 5a, 6), HCV s detekcí gibridizatsionnofluorestsentnoy v "reálném čase" zahrnuje: reagenční Popis objem, ml Max PCR mix-1-FRT genotypů HCV 1b / 3a PCR smes- 1-FRT HCV genotypy 1A / 2 PCR mix-1-FRT HCV EKR / genotypy 4 PCR mix-1-FRT genotypů HCV 5a / 6 RT-PCR směs-2-FEP / FRT polymerázy (TaqF) FFP cDNA HCV genotypy 1b / 3a FFP cDNA HCV genotypy 1a / 2 FFP HCV cDNA EKR / 4 genotyp FFP KDN HCV genotypy 5a / 6 TE pufru trubice 0,6 0,6 1 0,6 1 tuba 1 tuba 1 tuba 0,6 0,3 0,03 4 4 trubky zkumavky 1 zkumavka 0,2 0,2 ​​0 1 trubice, únor 1 lahvička 0,2 0,5 1 tuba 1 tuba činidlo kit je určen pro držení 55 test (220 amplifikačních reakcí), včetně kontrol. V sestavě tvoří 4, 5 a 6. Souprava činidel připojených stupeň kontrolní vzorky pro extrakci: 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 13 z 32.

14 FORMAT FRT Popis Hlasitost činidlo, ml Max OKO EKR STI-248-rec 0,5 0,5 1 tuba 1 tuba PCR RESEARCH USPOŘÁDÁNÍ PCR studie se skládá z následujících kroků: Extrakce RNA z klinických vzorků. Provedení reakce reverzní transkripce. Provedení zesílení s detekcí hybridizace - fluorescencí v režimu "v reálném čase". Analýza a interpretace výsledků. Podrobné údaje o postupu analýzy je v závislosti na typu použitého zařízení je uveden v části „Pokyny pro použití kitu reagencií pro stanovení a rozlišení virových genotypů hepatitidy C (HCV) v klinických vzorcích pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s detekcí hybridizace-fluorescence“ AmpliSens HCV genotyp-FL »», vyvinutý Ústřední výzkumného ústavu epidemiologie FBUN. RNA EXTRAKCE Z POŽADOVANÝCH VZORKŮ POZOR! Při práci s RNA, je nutné použít jednorázové plastové spotřební materiál se speciálním označením «RNasefree», «DNázou bez» pouze. RNA extrakce kitů reagencií použité doporučuje FBUN CRI Epidemiology: pomocí operačního postupu Kit "ribo-Sorb" reakční složky, viz příloha 1 "Extrakce RNA s použitím reagenční soupravy" ribo-Sorb.“. pomocí reagenciemi soupravy „ribo-prep“ postup funguje cm. v dodatku 2 „Extrakce RNA s použitím reagenční soupravy“ ribo-prep“. POZOR! Výsledný přípravek RNA nesmí být skladovány, opačná reakce je 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / str. 14 32

15 FORMAT FRT transkripce by měla být provedena ihned po získání vzorku RNA. PROVEDENÍ REAKČNÍ REAKCE Celkový objem reakční směsi byl 20 μl, včetně objemu vzorku RNA 10 μl. POZOR! Při práci s RNA je nutné používat pouze jednorázové plastové spotřební materiály, které mají speciální označení "RNasefree", "DNase-free". A. Příprava zkumavek pro reverzní transkripci Pro vložení reagencií a vzorků RNA do zkumavek se používají jednorázové špičky s filtry. POZOR! Složky reakční směsi by měly být smíchány bezprostředně před reakcí reverzní transkripce. 1. Než začnete rozmrazovat práci, důkladně promíchejte na vířivém RT-mix a RT-G-mix-1. Vypusťte kapky z čepiček zkušebních trubek. 2. Pro provedení reakce reverzní transkripce vyberte požadovaný počet trubek s objemem 0,2 nebo 0,5 ml (podle modelu použitého termostatu nebo termocyklu) s přihlédnutím k počtu testovacích a kontrolních vzorků (jedna kontrola extrakce (OK)). Označte zkumavky. 3. Při provedení reverzní transkripce vzorků: a) Připravte reakční směs na 12 reakcí. K tomu se přidá 5 μl RT-G-mix-1 do zkumavky s RT-mixem, důkladně promíchejte na víru a sražte kapky z víčka zkumavky. b) Přidejte 6 μl revertázy (MMlv) do výsledného roztoku, pipetujte 5x, promíchejte s vírem. Odstraňte kapky z víčka zkumavky krátkým odstředěním. 4. Při provádění reverzní transkripce méně než 10 vzorků: Reakční směs se připraví v jediné zkumavce následujícím způsobem: 10 μl RT-mix, 0,4 μl RT-G-mix-1 a 0, 5 μl revertázy (MMlv) (viz také tabulka 1). Při zavádění směsi RT-G-mix-1 a revertázy (MMlv) do směsi by mělo být každé činidlo pipetováno nejméně pětkrát. Směs důkladně promíchejte na víru a sražte kapky z víčka zkumavky. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 15 z 32

16 FRT FORMAT UPOZORNĚNÍ! Revertáza (MMlv) je citlivá na teplo! Nenechávejte jej při pokojové teplotě dlouho! Ihned po použití vyčistěte chladničku v mrazicím boxu! Objem reakčního činidla na jednu reakci (l) počet klinických vzorcích schématu připraví reakční směs 10,00 0,4 0,5 RT-mix RT-G-mix-1 reverzní transkriptázy (MMLV), 3. dubna 8 3 2 4, Přidá se 10 μl připravené reakční směsi do připravených zkumavek. Tabulka 1 6. Přidejte 10 μl vzorků RNA izolovaných z klinických a kontrolních vzorků do připravených zkumavek podle označení. Mírně promíchejte na víru a sražte kapky z víčka zkumavky. POZOR! Při přidávání vzorků RNA izolovaných pomocí soupravy činidel RIBO-Sorb je nutné vyhnout se tomu, aby se sorbent dostal do reakční směsi. B. Provedení reakce reverzní transkripce 1. Trubice vložte do termocyklu (termostatu) na 37 ° C po dobu 30 minut. POZOR! Pokud se používá pro nastavení reakce reverzní transkripce cyklovače s detekčním systémem v „reálném čase“, musí program zařízení pro provádění programu (viz. Tabulka. 2 a „pokyny pro použití reagenciemi soupravy pro detekci a diferenciaci viru genotypů hepatitidy C (HCV) v klinických vzorcích pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s detekcí hybridizace-fluorescenční „AmpliSens HCV genotypem-f» », navržený FBUN Epidemiology CRI). Tabulka 2 4 objemy reakčních složek zavedených jsou uvedeny v závislosti na počtu vzorků (1 klinických vzorků a izolace RNA řídící stupeň) a zásob u 1 vzorku. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 16 z 32

17 FORMAT FRT program pro reverzní transkripci do termocyklerů s detekčním systémem v „reálném čase“ reakce 5 Krok teploty, C Čas fluorescence Měření Počet cyklů 1 min 2. Po ukončení reakční trubky se přidá 20 mikrolitrů DNA pufru, s použitím nové Hrot s filtrem pro každý vzorek. Mírně promíchejte na víru a sražte kapky z víčka zkumavky. Získaný v reverzní transkripční reakci kdnk se používá pro PCR amplifikaci. Hotový lék kdnk může být skladován při teplotě nejvýše 16 ° C po dobu 1 týdne nebo při teplotě nepřesahující mínus 68 ° C během roku. Amplifikace s detekcí v „reálném čase“ A. Příprava zkumavek pro amplifikaci výběr trubek pro amplifikace závisí na termocykleru. Pro vložení reagencií, vzorků kdnk a kontrolních vzorků do zkumavek se používají jednorázové špičky s filtry. Celkový objem reakční směsi byl 25 ul, včetně objemu vzorku kdnk 10 ul. POZOR! Složky reakční směsi by měly být smíchány bezprostředně před provedením testu PCR. Promíchávání reakčních složek, vztaženo na požadované množství reakcí, včetně testování zkušebních a kontrolních vzorků, podle vypočteného nezbytné tabulky (viz. Tabulka č. 3, 4). A1. Příprava trubek pro amplifikaci s použitím soupravy "PCR Kit" činidla varianta FRT-g1-4 příklad 5, Rotor-Gene 3000, nebo 6000 (Corbett Research, Austrálie); Rotor-Gene Q (Qiagen, Německo); iq5 (Bio-Rad, USA); Mx3000P (Stratagene, USA); „DT-96“ ( „DNA technologie“, Rusko) a doporučené FBUN CRI epidemiologie v pokynech pro použití tohoto kitu reagencií. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 17 z 32

18 FORMAT FRT 1. Před rozmrazit a důkladně se promíchá promíchejte všechny reagenciemi a sediment klesne na uzávěry trubice. 2. Zvolte požadovaný počet testovacích zkumavek pro zesílení s přihlédnutím k počtu testovacích a kontrolních vzorků (jedna kontrola extrakce RNA, dvě kontroly zesílení). Typ trubek by měl být vybrán v závislosti na použitém nástroji. POZOR! Každý vzorek se analyzuje za použití tří reakčních směsí, proto se pro každý vzorek musí připravit 3 zkumavky. Při použití nástrojů rotačního typu označte zkumavky "sample_1b / 3a", "sample_1a / 2" a "sample_over / 4". Při používání plochých zařízení používejte pro tyto účely značený stativ. 3. Pro přípravu reakčních směsí vyberte tři zkumavky o objemu 0,5 ml. Označte zkumavky "1b / 3a", "1a / 2" a "VKO / 4". 4. V každé ze tří zkumavek určených pro přípravu reakční směsi, aby se rychlost reakce je 1: 5 l RT-PCR mix-2-FEP / FRT, 0,5 l polymerázy (TaqF) a 10 ul odpovídající PCR-mix -1-FRT HCV genotyp (viz. také tabulka. 3), PCR-mix-1-FRT genotypů HCV 1b / 3a se zavádí do trubice «1b / 3a» atd. Výsledná reakční směs se víří a vysráží z víčka zkumavky. POZOR! Reakční směsi musí být připraveny s rezervou 1 vzorku (viz tabulka 3). 5. Přidejte 15 μl připravené reakční směsi do zkumavek určených pro zesílení podle označení, tj. reakční směs "1b / 3a" se zavádí do trubek označených "vzorek-1b / 3a" atd. 6. Připravené zkumavky upustit od reakční směsi v souladu s označením se přidá 10 ul cDNA vzorků získaných při reakce reverzní transkripce, v níž každý vzorek, zahrnující extrakci negativní kontrola (C-), požadované v 3 injekční lahvičky obsahující reakční výčepních směsi "1b / 3a", "1a / 2" a "VKO / 4". 7. Dejte kontrolní reakce: a) PCR negativní kontrola (K) se přidá do zkumavky obsahující reakční směs vnese «1b / 3a», «1a / 2" a "SAI / 4" v 10 ul TE pufru. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 18 z 32

19 FORMAT FRT b) pozitivní kontrola PCR (K + 1b / 3a) do zkumavky obsahující reakční směs «1b / 3a“ se přidá 10 ul cDNA FFP genotypů HCV 1b / 3A; c) PCR pozitivní kontrola (C + 1 a / 2) do zkumavky obsahující reakční směs «1a / 2" se přidá 10 ul cDNA FFP HCV genotypy 1a / 2; d) PCR pozitivní kontrola (C + EKR / 4), zkumavka obsahující reakční směs "SAI / 4" se přidá 10 ul FFP HCV cDNA EKR / genotyp 4. Schéma přípravy reakčních směsí pro objem varianta FRT činidla na reakci (l) č č klinické zkušební vzorky bodů 6 10,00 5,00 6 0,50 počet klinických vzorků + 1 ​​kontrolní RNA extrakce ve stupni 2 PCR + ovládání (N + 3, N počet klinických vzorků). PCR-směs-1- FRT HCV genotyp * RT-PCR směs-2-FEP / FRT * Tabulka 3 polymerázy (TaqF) *,,,,,,,,, 0 * Objemy činidel zavedených s rozpětím dané 1 vzorku. A2. Příprava zkušebních zkumavek pro amplifikaci s použitím sady „PCR kitu“ činidla varianta FRT-g Před zahájením rozmrazit, důkladně se promíchá promíchejte všechny reagenciemi a sediment klesne na uzávěry trubice. 2. Zvolte požadovaný počet testovacích zkumavek pro zesílení s přihlédnutím k počtu testovacích a kontrolních vzorků (jedna kontrola extrakce RNA, dvě kontroly zesílení). Typ trubek by měl být vybrán v závislosti na použitém nástroji. POZOR! Každý vzorek se analyzuje za použití čtyř reakčních směsí, proto se pro každý vzorek musí připravit 4 zkumavky. Při použití 0,2 ml zkumavek pro značku rotační trubkové „obraztsa_1b / 3a» zařízení "obraztsa_1a / 2", "obraztsa_vko / 4" a "obraztsa_5a / 6", v tomto pořadí. Při použití plochých zařízení nebo při použití odizolovaných 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 19 z 32

20 testovacích trubek FORMAT FRT pro přístroje typu rotoru používá pro tyto účely značený stativ. 3. Zvolte čtyři zkumavky o objemu 0,5 ml pro přípravu reakčních směsí. Label trubky «1b / 3a», «1a / 2",„SAI / 4»a" 5a / 6". 4. V každé ze čtyř trubek určených k přípravě reakční směsi, aby se rychlost reakce je 1: 5 l RT-PCR-mix-2- FRT genotypu HCV (viz také tabulka 4..), S PCR směsi 1- FRT HCV genotypy 1b / 3a jsou vloženy do zkumavky "1b / 3a" atd. Výsledná reakční směs se víří a vysráží z víčka zkumavky. Schéma přípravy reakční směsi variantní FRT na reakční objem reakčního činidla (l) č č klinické zkušební vzorky bodů 7 10,00 5,00 0,50 FEP / FRT, 0,5 l polymerázy (TaqF) a 10 ul odpovídající PCR-mix -1-PCR směs-1- FRT HCV genotyp * RT-PCR směs-2-FEP / FRT * Tabulka 4 polymerázy (TaqF) *,,,,,,,,, 0 * částky uvedené reakční složky zavedené s okrajem pro 1 vzorek. 5. Přidejte 15 μl připravené reakční směsi do zkumavek určených pro zesílení podle označení, tj. Reakční směs byla «1b / 3a» zavádí do trubek označených „obraztsa_1b / 3a» atd V případě použití pro amplifikační reakce stripovannyh trubky, reakční směsi, aby se v souladu se schématu na obr.1. 7 Počet klinických vzorků + 1 ​​kontrolní RNA extrakce ve stupni 2 PCR + ovládání (N + 3, N počet klinických vzorků). 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 20 z 32

21 FORMAT FRT 4 trubky použité pro stanovení klinického vzorku směs «1b / 3a» Směs «1a / 2" směs "SAI / 4" směs "5a / 6" Směs«1b / 3a»Směs« 1a / 2" směs " VKO / 4 »Směs« 5a / 6 »Obrázek 1. Schéma pro zavedení reakčních směsí a vzorků při použití odizolovaných trubek pro výrobu PCR. 6. Připravené zkumavky upustit od reakční směsi v souladu s označením se přidá 10 ul cDNA vzorků získaných při reakce reverzní transkripce, každý vzorek, zahrnující extrakci negativní kontrola (C-), které mají být provedeny ve 4 zkumavek obsahujících reakční Nadávkuje směsi "1b / 3a", "1a / 2", "EKO / 4" a "5a / 6". 7. Dejte kontrolní reakce: a) PCR negativní kontrola (K) se přidá do zkumavek obsahujících reakční směsi vnese «1b / 3a», «1a / 2", "SAI / 4" a "5a / 6" v 10 ul TE pufru. b) pozitivní kontrola PCR (K + 1b / 3a) do zkumavky obsahující reakční směs «1b / 3a“ se přidá 10 ul cDNA FFP genotypů HCV 1b / 3a; c) PCR pozitivní kontrola (C + 1 a / 2) do zkumavky obsahující reakční směs «1a / 2" se přidá 10 ul cDNA FFP HCV genotypy 1a / 2; d) PCR pozitivní kontrola (C + EKR / 4), zkumavka obsahující reakční směs "SAI / 4" se přidá 10 ul FFP HCV cDNA EKR / 4 genotyp; d) PCR pozitivní kontrola (C + 5a / 6) v trubce se reakční směs «5a / 6" se přidá 10 ul cDNA FFP HCV genotypy 5a / 6. B. Vedení detekci amplifikace v „reálném čase“ zařízení 1. Program (cyklovač s detekčním systémem v „reálném čase“) provádět odpovídající amplifikaci a detekci fluorescenčního signálu programu „AmpliSens-1“ (viz. Tabulka. 5, 6 ). Tabulka 5 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 21 z 32

22 FORMAT FRT «AmpliSens-1‚program točivých zařízení 8 teploty Počet Doba trvání měření Krok C fázové cykly fluorescence přidržení / držet min 1 Temp-ry 95 5 Cyklistika / 5 cyklování 95 5 kole 2 / FAM / zelené 40 kole 2 JOE / žlutá z tabulky 6 „AmpliSens-1“ pro tablety typu zařízení 9 a zařízení inteligentní Cycler II (Cepheid, USA) Krok teplota Doba trvání měření číslo od kroku cyklů fluorescence min (900 až 10), s od 95 do 5 s FAM, JOE / hexan / Cy z 2. Nastavte trubky pro nástroje do modulu reakce buněk. 3. Spusťte program zesílení s detekcí fluorescenčního signálu. 4. Po ukončení programu začněte analyzovat a interpretovat výsledky. Analýza a interpretace výsledků analýzy hmoty s programovým vybavením používaným na zařízení k provádění PCR v detekci c „reálném čase“. Křivky byly analyzovány za akumulaci fluorescenčního signálu v kanálu pro fluoroforu FAM (nebo podobně) a kanálu pro fluorofor JOE (nebo podobné). Výsledky jsou interpretovány na základě přítomnosti (nebo nepřítomnosti) z příkladu 8, Rotor-Gene 3000, nebo 6000 (Corbett Research, Austrálie), Rotor-Gene Q (Qiagen, Německo). 9 Například icycler iq5 (Bio-Rad, USA); Mx3000P, Mx3005 (Stratagene, USA); „DT-96“ ( „DNA technologie“, Rusko) a doporučené FBUN CRI epidemiologie v pokynech pro použití tohoto kitu reagencií. 10 Pro model Smart Cycler II (Cepheid, USA). 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / str. 22 32

23 FORMAT FRT průsečík křivky fluorescence instalován na vhodnou prahovou hodnotou řádku, který zjišťuje přítomnost (nebo nepřítomnost) vzorku hodnoty cDNA prahový cyklus Ct v odpovídajícím sloupci v tabulce výsledků. Výsledek zesílení kanálu, se považuje za pozitivní v případě, že fluorescenční křivka má typickou PCR v reálném čase ve tvaru písmene S forma, jakmile protíná práh řádek v výraznému zvýšení fluorescence, negativní v nepřítomnosti křivky typického tvaru a průsečíkem s prahovou linie (žádná hodnota Ct nebo Cp) a pochybné ve všech ostatních případech. Tabulka 7 ukazuje kanály, skrze které jsou detekovány HCV genotypy pro každou reakční směs. Tabulka 7 Reakční směs «1b / 3a» «1a / 2" "SAI / 4" "5a / červen 11" Channel Detekovatelné genotypy HCV FAM / zelená 1b 1a ASD 5a Joe / hexan / žlutá / Cy3 3a účetních výsledků u kontrolních vzorků výsledky PCR analýza je považován za spolehlivý, jestliže výsledky získané absolvování zkušebních vzorků v souladu s kontrolními výsledky hodnocení tabulka reakcí (viz. tabulka č. 8). 11 Zahrnuto do verze sady FRT-g1-6 pro PCR kit. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 23 z 32

24hodinový FRT ovládání reaktivní Nye směs OK K K + 1b / 3a Výsledky pro ovládání různých fázích analýzy FAM / zelená žádná hodnota Ct ne hodnotu Ct pod limitní hodnotu TABULKA 8 «1b / 3a» «1a / 2" „SAI / 4 »« 5a / 6 '12 výsledky zesílení kanálu JOE / HEX / Yellow / Cy3 FAM / Green JOE / HEX / Yellow / Cy3 FAM / Green JOE / HEX / Yellow / Cy3 FAM / Green JOE / HEX / Yellow / Cy3 No význam ct č ct hodnota pod mezní hodnotu k + 1 a / 2 * * žádná hodnota ct žádná hodnota ct Ne ct hodnota Ne ct hodnota je nižší než mezní hodnota žádná ct hodnota otsuts tvuet Ct hodnota Ne Ct hodnota žádná hodnota Ct žádná hodnota Ct žádná hodnota Ct žádná hodnota Ct * * * * * * pod mezní hodnotu pod limitní hodnotu K + EKR / 4 * * * * * * * * pod mezní hodnotu pod limitní hodnotu K + 5a / 6 * * * * * * * K této reakční směsi nebyl testován. * Pod limitní hodnoty VAROVÁNÍ! Hodnoty Ct Hranice je znázorněno na vložce do PCR kitu. Interpretace výsledků při studiu klinických vzorků pod mezní hodnotu 1. genotypu HCV přítomného ve vzorku je stanovena porovnáním zesílení ve třech výsledky ( „PCR kitu“ varianta FRT-g1-4) nebo čtyř trubek (pro „PCR kitu“ varianta FRT-g1-6) podle tabulky. 7, kde a) V případě, že tabulka výsledků na vzorku se stanoví hodnota Ct, jeden odpovídající genotyp HCV RNA, pak vrátí výsledek „genotypu“; b) V případě, že tabulka výsledků pro oba vzorky nebo více hodnot Ct stanoveno, pak je dána dvou, tří, a tak dále. d. genotyp. Výjimkou je následující případ: V případě, že vzorek stanovena hodnota Ct se k reakční směsi „SAI / 4“ kanálu JOE / Hex / žlutá / Cy3 (4 genotypu HCV) a «1 b / 3a» Reakční směs kanál FAM / zelená (1b genotypem HCV), přičemž se hodnota Ct 4. genotypu větší Ct hodnota pro první genotyp na 10 nebo více cyklů, vydaném 12 je součástí PCR kit varianty FRT-g1-6. 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / str. 24 32

25 FORMAT FRT výsledek "genotypu 4". V tabulce 2. V případě, že výsledky pro Ct hodnota vzorku je určena pouze pro SAI (reakční směsi „SAI / 4», FAM / zelená kanál) a je pod mezní hodnotou stanovenou ve vložce, výsledek je uveden «HCV genotyp nestanoveno“. Proto, je-li známo, že koncentrace HCV RNA ve vzorku se pohybuje v analytické citlivosti činidel, výsledek je uveden «HCV genotyp neurčeno důvodu nízké virové zátěže“. 3. Pokud je v tabulce výsledků pro vzorky žádné hodnoty Ct pro všechny genotypy a hodnoty Ct pro EKR (FAM kanál v PCR-mix-1-FRT HCV EKR / genotypu 4) není definován nebo překročí hranici (označený ve vložce), poté Chci zopakovat studie PCR vzorku z extrakce krok RNA. POZOR! 1. V případě, že hodnota Ct alespoň v jednom vzorku z kroku PCR pozitivní kontrola (K + 1b / 3a, K + 1a / 2, K + EKR / 4 nebo K + 5a / 6) přesahuje mezní hodnotu určenou ve vložce, nebo chybí, je třeba opakovat studie PCR pro všechny vzorky, počínaje krokem extrakce. 2. V případě, že negativní kontroly pro extrakci RNA (OK) na alespoň jedné z reakčních směsí «1b / 3a», «1a / 2», «5a / 6" některého z použitých kanálů a / nebo„SAI / 4, k reakční směsi „kanál zjištěn pozitivní JOE / HEX / žlutá / signál Cy3, opakujte PCR pro všechny vzorky studie, pro které byla tato reakční směs HCV genotyp určí z extrakce krok RNA. 3. Pokud je zjištěna negativní kontrolní PCR (K) pro každou reakční směsi podle některého z kanálů pozitivní signál, opakujte PCR pro všechny vzorky studie, pro které byla tato reakční směs HCV genotyp určí z extrakce krok RNA. 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / str. 25 z 32

26. SKLADOVATELNOST, dopravní a skladovací podmínky trvanlivost. 12 měsíců. kit činidlo po datu expirace není předmětem žádosti. Doba použitelnosti činidel odpovídá otevřené datum vytištěné na štítcích na neotevřené činidel, není-li v instrukci uvedeno jinak. Doprava. Sada činidel přepravovaných při teplotě od 2 do 8 ° C po dobu až 5 dnů. Při příjmu demontovány v souladu s skladovacích teplot. Skladování. Soupravy činidel "ribo-Sorb" a "r ibo-prep" uložen při teplotě 2 až 8 ° C Stavebnice činidel „Reverte-L» a «PCR kit“ kromě OKO, TE pufru a EKR STI-248-rec skladování při teplotě ne vyšší než minus 16 C. OKO, TE pufru a EKR STI-248-rec z "PCR kitu" uložen při teplotě 2 až 8 ° C PCR směs byla-1-FRT genotypů HCV 1b / 3a PCR mix-1-FRT HCV genotypy 1a / 2, PCR-mix-1-FRT HCV EKR / 4 genotyp a PCR-směs-1-FRT genotypů HCV 5a / 6 uloženy na tmavém místě. Podmínky dovolené. Pro léčebné a preventivní a hygienické zařízení. Stížnosti na kvalitu souboru „AmpliSens na HCV genotyp-FL» činidel směřující k výrobci FBUN Central Research Institute of Epidemiology (ul. Novogireevskaya, d. 3a) práce divize s nároky a výcvikové organizace (tel. (495) fax (495), zpětná vazba a návrhy o produktu "AmpliSens" můžete nechat, vyplnění formuláře na webových stránkách spotřebitele: 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 26 32.

27 DODATEK 1. Extrakce RNA Extrakce RNA za použití „ribo-Sorb“ reagenční soupravy Postup 1. lyzačního roztoku a promývací roztok 1 (v případě, že byly skladovány při 2-8 ° C), zahřejte na 60 ° C až do úplného rozpuštění krystalů. 2. Zvolte požadovaný počet testovacích zkumavek na jedno použití o 1,5 ml (včetně záporné kontroly extrakce). Označte zkumavky. 3. Na dně každé zkumavky přidejte 10 μl EKO STI-248-rec. 4. Do testovacích zkumavek přidejte 450 μl lýzovacího roztoku. Označte zkumavky. Poznámka: S velkým objemem vzorku, aby se usnadnila izolace postup se smísí v oddělené nádobě lyzačního roztoku a EKR STI-248-rec (na základě jednoho vzorku 450 ul lyzačního roztoku a 10 l EKR STI-248-rec) následovaný rozteč 450 ul do předem připravených zkumavek o objemu 1,5 ml. 5. Přidejte 100 μl vzorku do zkumavek s lýzovým roztokem a VKO za použití špiček s filtrem. V negativní kontrolní (OK) trubici extrakce přidejte 100 μl OKO. 6. Uzavřené vzorek důkladně promíchány vortexováním a protsentrifugirovat po dobu 5 sekund v 5 tisíc otáček / min v mikrocentrifuze pro odstranění kapek z vnitřního povrchu víka trubice. 7. Resuspendujte sorbent a energicky promíchejte na víru. Přidejte 25 μl resuspendovaného sorbentu do každé zkumavky s odděleným hrotem. 8. Obsah vířivých zkumavek promíchejte a ponechejte 10 minut při pokojové teplotě, důkladně promíchejte každých 2 minuty. 9. Odstřeďujte mikrocentrifugační zkumavky na 7. g (například 10 tisíc otáček / min po dobu MiniSpin Centrifuge, Eppendorf) po dobu 1 min. 10. Vezměte supernatant z každé trubice samostatným hrotem pomocí vakuové odsávací jednotky. 11. Přidejte do trubice 400 ul mycí roztok 1. Mix vířením do úplného resuspendování sorbentu. Centrifugujte zkumavky v mikrocentrifugě při 7000 g po dobu 1 minuty. Collect supernatantu 2x (RG, IQ, Mx, dt, SC) / VER / str. 27 32

28 RNA EXTRACTION z každé trubky s odděleným hrotem pomocí vakuové odsávací jednotky. 12. Do zkumavek přidejte 500 μl promývacího roztoku, 3. promíchejte vír do úplné resuspendace sorbentu. Centrifugujte zkumavky v mikrocentrifugě při 7000 g po dobu 1 minuty. Vyberte řešení pro praní 3 z každé trubky s odděleným hrotem pomocí jednotky podtlakového odsávání. 13. Do zkumavek přidejte 400 μl promývacího roztoku 4. Míchá se na víru, dokud se sorbent úplně nerozpustí. Centrifugujte zkumavky v mikrocentrifugě při 7000 g po dobu 1 minuty. Úplně odstraňte mycí roztok 4 z každé trubky pomocí samostatného hrotu pomocí vakuové odsávací jednotky. 14. Vysušte sorbent umístěním trubek s otevřenými víčky v termostatu při teplotě 60 ° C po dobu 15 minut. 15. Resuspendujte sorbent v 50 μl RNA pufru. Zahřejte sušárně při teplotě 60 ° C po dobu 2 minut, ve směsi na vortexu a odstředivky, aby se vysrážel sorbentu na 12 tisíc g (např., Ot / min pro MiniSpin Centrifuge, Eppendorf) po dobu 1 min. POZOR! Výsledný preparát RNA není předmětem skladování, reverzní transkripční reakce by měla být provedena bezprostředně po získání vzorku RNA. Roztok RNA pro reakci je velmi opatrný, bez zachycení sorbentu. Pokud je sorbent narušen, je nutné ho vysrážet na odstředivce. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 28 z 32

29 Dodatek 2 Extrakce RNA Extrakce RNA s použitím soupravy „ribo-prep“ činidel Postup 1. lyzační roztok (pokud byl uložen při teplotě 2 až 8 ° C), teplo při 65 ° C až do úplného rozpuštění krystalů. 2. Zvolte požadovaný počet jednorázových testovacích zkumavek o 1,5 ml (včetně negativních a pozitivních kontrol extrakce). 3. Na dně každé zkumavky přidejte 10 μl EKO STI-248-rec. 4. Přidejte 300 μl lýzovacího roztoku do zkumavek. Označte zkumavky. Poznámka: S velkým objemem vzorku, aby se usnadnila izolace postup mísit v samostatné lahvičce lýze a EKR STI-248-rec (na základě jednoho vzorku 300 ul lyzačního a 10 ul EKR STI-248-rec) následovaný rozteč 300 ml směsi do předem připravených zkumavek o objemu 1,5 ml. 5. V trubkách s roztokem pro lýzu a VKO přidejte 100 μl vzorku pomocí špiček s filtrem. V negativní kontrolní (OK) trubici extrakce přidejte 100 μl OKO. 6. Zkumavky se důkladně promísí vířením, protsentrifugirovat po dobu 5 sekund v mikroodstředivce k odstranění kapek z vnitřního povrchu krytu, a zahřát po dobu 5 minut při 65 ° C v inkubátoru. 7. Do zkumavek přidejte 400 μl srážecího roztoku a důkladně promíchejte vírem. 8. Odstřeďujte mikrocentrifugační zkumavky na 12 tisíc g (např., Ot / min pro MiniSpin Centrifuge, Eppendorf) po dobu 5 minut. 9. Opatrně pryč supernatant bez narušení peletu vakuové vývěvy a samostatnou špičku pro každý vzorek. 10. Přidejte do trubice 500 praní ul roztoku 3, uzavřete víko, jemně opláchnuty sraženina invertující zkumavky 35 krát. Je možno provádět postup, současně pro všechny trubky, je nutné pokrýt zkumavky do stojanu na horní straně víka, nebo jiného stojanu, stiskněte je a zase stativ. 11. Centrifugujte při 12 000 g po dobu 1 až 2 minut v mikrocentrifugu. 12. Opatrně, bez zachycení sraženiny, byl supernatant pryč, 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / str. 29 32

30 RNA EXTRACTION za použití vakuové odsávací jednotky a samostatného hrotu pro každý vzorek. 13. Přidejte 200 μl promývacího roztoku 4 do zkumavek, pevně zavřete víčka a peletu opatrně promyjte inverzí trubek 3-5krát. Postup můžete provádět současně pro všechny trubky, proto je potřeba pokrýt trubky ve stativu shora s víkem nebo jiným stativem, zatlačte je a otočte stativ. 14. Centrifugujte při 12 000 g po dobu 2 minut v mikrocentrifugu. 15. Opatrně bez zachytávání sedimentu pečlivě vybírejte supernatant pomocí vakuové odsávací jednotky a samostatného hrotu pro každý vzorek. 16. Umístěte trubky do termostatu při teplotě 65 ° C po dobu 5 minut, aby se usušil kal (s otevřenými kryty trubek). 17. Do zkumavek přidejte 50 μl RNA pufru. Míchání na víru. Umístěte do termostatu na 65 ° C po dobu 5 minut a pravidelně ho protřepejte na víru. 18. Centrifugujte zkumavky rychlostí 12 000 g po dobu 1 minuty v mikrocentrifugu. Supernatant obsahuje purifikovanou RNA. Vzorky jsou připraveny pro reakci reverzní transkripce a PCR. POZOR! Výsledný preparát RNA není předmětem skladování, reverzní transkripční reakce by měla být provedena bezprostředně po získání vzorku RNA. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 30 z 32

31 SYMBOLY POUŽITÉ V TISKÁRNYCH PRODUKTECH Číslo dílu Kód šarže Pozor! Naleznete v přiloženém maximální dokumentace počtu testovaného produktu je určena pro diagnostické použití in vitro k dnešnímu dni změny v teplotě mezní teplota horní hranice, naleznete v návodu k použití se vyhýbejte slunečnímu světlu Datum výroby Výrobce 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p 31 z 32

32 Problém LA IVI místo mění zápatí zápatí list podstatu změn změny přidány katalogové číslo R-V1-G (1-4) - 2 (RG, iQ, Mx, Dt, SC) pro vytvoření kompletní sadu 3 Odstraňte katalogová čísla pro formulace 1 a 4 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / strana 32 z 32

Amplisense hcv fl

loading...
Stages of hepatitis c
Mpiviropack cena

Vše o hepatitidě C

loading...

Léčba, příznaky, léky

Hepatitida s rcc ampliconem hcv fl

loading...

Hepatitida s rcc ampliconem hcv fl

loading...

Hepatitida se nazývá akutní a chronické zánětlivé onemocnění jater, které nejsou ohniskové, ale běžné. U různých hepatitid jsou metody infekce různé, liší se také v závislosti na rychlosti progrese onemocnění, klinických projevech, metodách a prognóze terapie. Dokonce i symptomatologie různých typů hepatitidy je odlišná. A některé příznaky jsou závažnější než jiné, což je způsobeno typem hepatitidy.

Hlavní příznaky

loading...
  1. Žlutost. Symptom se často vyskytuje a je způsoben tím, že bilirubin vstupuje do krve pacienta s poškozením jater. Krev, která cirkuluje tělem, přenáší do orgánů a tkání a zbarví je žlutě.
  2. Výskyt bolesti v oblasti pravého hypochondria. Vzniká z důvodu zvýšení velikosti jater, což vede k výskytu bolesti, které jsou tupé a prodloužené nebo mají paroxysmální povahu.
  3. Poškození zdraví, doprovázené horečkou, bolestmi hlavy, závratě, poruchami trávení, ospalostí a letargií. To vše je důsledkem působení bilirubinu na tělo.

Akutní a chronická hepatitida

loading...

Hepatitida u pacientů má akutní a chronické formy. V akutní formě se projevují v případě poškození virových jater, stejně jako v případě otravy různými typy jedů. U akutních forem onemocnění se stav pacientů rychle zhoršuje, což přispívá k urychlenému rozvoji příznaků.

S touto formou onemocnění jsou možné příznivé předpovědi. S výjimkou její transformace na chronickou. V akutní formě je onemocnění snadno diagnostikováno a lépe se léčí. Neošetřená akutní hepatitida se snadno rozvíjí do chronické formy. Někdy v případě těžké otravy (např. Alkoholu) se chronická forma vyskytuje sama. V chronické formě hepatitidy dochází k procesu náhrady pojivové tkáně jaterních buněk. Je slabě vyjádřena, je pomalá a proto někdy zůstává nediagnostikovaná až do počátku jaterní cirhózy. Chronická hepatitida je léčena horší a prognóza její léčby je méně příznivá. Při akutním stadiu nemoci značně zhoršuje zdraví, žloutenka se vyvíjí, se objeví intoxikace, práce je pokles funkce jater bilirubin se zvyšuje v krvi. S včasnou detekcí a účinnou léčbou hepatitidy v akutní formě se pacient nejčastěji zotavuje. S délkou onemocnění po dobu delší než šest měsíců dochází k hepatitidě v chronické formě. Chronická forma onemocnění vede k vážným poruchám v těle - zvýšení slezina a játra metabolismus je narušen, komplikace vznikají jako cirhóza jater a tvorbu rakoviny. Pokud má pacient malou imunitu, schéma terapie je nesprávné nebo existuje závislost na alkoholu, přechod hepatitidy na chronickou formu ohrožuje život pacienta.

Typy hepatitidy

loading...

Hepatitida má několik typů: A, B, C, D, E, F, G, jsou také nazývány virové hepatitidy, protože příčinou jejich výskytu je virus.

Tento typ hepatitidy se také nazývá Botkinova nemoc. Má inkubační dobu trvající 7 dní až 2 měsíce. Jeho příčinný činitel - RNA virus - může být přenášen od nemocného člověku zdravému člověku prostřednictvím špatně kvalitní produktů a vody, kontakt s domácími předměty, které pacient použil. Hepatitida A je možná ve třech formách, jsou rozdělena podle síly projevu nemoci:

  • v akutní formě s žloutenkou, játra jsou vážně poškozena,
  • když subakutní bez žloutenky, můžeme mluvit o lehčí verzi nemoci,
  • v subklinické podobě, nemůžete ani zaznamenat příznaky, ačkoli infikovaný je zdrojem viru a je schopen infikovat ostatní.

Toto onemocnění se také nazývá sérová hepatitida. Je doprovázeno zvýšením jater a sleziny, výskytem bolesti v kloubech, zvracením, teplotou, poškozením jater. Teče buď v akutní nebo chronické formě, což je podmíněno stavem imunity nemocného. Způsoby infekce: během injekcí s porušením hygienických pravidel, sexuálním stykem, při transfuzi krve, použitím špatně dezinfikovaných lékařských přístrojů. Doba inkubace je 50 ÷ 180 dnů. Výskyt hepatitidy B klesá s očkováním.

Tento typ onemocnění je jednou z nejzávažnějších onemocnění, protože je často doprovázena cirhózou nebo rakovinou jater, což vede k smrtelnému výsledku. Nemoc není léčitelná a navíc, jednou se objevil hepatitida C, může být člověk opakovaně infikován stejným onemocněním. Léčba HCV není snadné: po akutní hepatitidě C se 20% lidí zotavuje a u 70% pacientů není tělo schopno léčit samotný virus a onemocnění se stává chronickým. Aby zjistili důvod, proč se někteří vyléčili a jiní nejsou, přesto to nebylo možné. Chronická forma samotné hepatitidy C nezmizí, takže je třeba léčit. Diagnostiku a léčbu akutních forem HCV provádí lékař infekční choroby, chronická onemocnění - hepatolog nebo gastroenterolog. Lze nakazit při transfuzi plazmy nebo krve z infikovaného dárce, za použití špatně ošetřené MEDINSTRUMENT, sexuálně a nemocné matka přechází infekce na dítě. Virus hepatitidy C (HCV) se rychle rozšiřuje po celém světě, počet pacientů již přesáhl sto a sto milionů lidí. Předtím HCV nepodléhal léčbě, ale nyní může být onemocnění vyléčeno použitím moderních antivirus s přímým účinkem. Pouze tato terapie je poměrně drahá, ale ne každý si to může dovolit.

Tento typ hepatitidy D je možný pouze při koinfekci viru hepatitidy B (koinfekce - případ infekce jedné buňky různými typy virů). Je doprovázen masivním poškozením jater a akutním průběhem onemocnění. Způsoby infekce - získání viru choroby do krve zdravého člověka z nosiče viru nebo nemocné osoby. Doba inkubace trvá 20 ÷ 50 dní. Vnější průběh onemocnění připomíná hepatitidu B, ale jeho forma je těžší. Po chronické cirhóze se může stát chronickým. Je možné provést očkování podobné očkování proti hepatitidě B.

Mírně připomíná hepatitidu A podle průběhu a mechanismu přenosu, protože je přesně přenášena krví. Jeho zvláštností je vznik bleskově rychlých forem, který způsobuje smrtelné následky po dobu nepřesahující 10 dní. V ostatních případech může být účinně vyléčeno a prognóza obnovy je často příznivá. Výjimkou může být těhotenství, protože riziko ztráty dítěte je téměř 100%.

Tento typ hepatitidy ještě nebyl studován. Je známo pouze to, že nemoc je způsobena dvěma různými viry: jeden izolovaný od dárce krve, druhá nachází ve stolici pacientů užívajících hepatitida po transfúzi krve. Symptomy: žloutenka, horečka, ascites (nahromadění tekutiny v břiše), zvětšená játra a slezina, zvýšení hladin bilirubinu a jaterních enzymů, výskyt změn v moči a stolici, stejně jako obecná intoxikace. Efektivní metody léčby hepatitidy F ještě nebyly vyvinuty.

Tento typ hepatitidy je podobný hepatitidě C, ale není tak nebezpečný, protože nepodporuje výskyt cirhózy a rakoviny jater. Cirhóza se může objevit pouze v případě koinfekce hepatitidy G a C.

Diagnostika

loading...

Vírová hepatitida je podobná svým příznakům navzájem, stejně jako některé jiné virové infekce. Z tohoto důvodu je obtížné přesně určit diagnózu pacienta. V zájmu objasnění typu hepatitidy a správného účelu terapie jsou proto laboratorní krevní testy nutné k identifikaci markerů - indikátorů, které jsou specifické pro každý typ viru. Po zjištění přítomnosti takových markerů a jejich poměru lze určit stádium onemocnění, jeho činnost a možný výsledek. Pro sledování dynamiky procesu se po určité době opakuje průzkum.

Jak se léčí hepatitida C?

loading...

Současné léčebné režimy pro chronické HCV snížena na kombinované antivirové terapie, včetně antivirusniki přímého typu působící sofosbuvir, velpatasvira, daklatasvira, ledipasvira v různých kombinacích. Někdy se přidávají ribavirin a interferony, aby se zvýšila jejich účinnost. Tato kombinace účinných látek zastavuje replikaci virů, čímž zachraňuje játra před ničivými účinky. Tato terapie má několik nevýhod:

  1. Náklady na léky na potírání viru hepatitidy jsou vysoké, ne každý si je může koupit.
  2. Užívání některých léků je doprovázeno nepříjemnými vedlejšími účinky, včetně horečky, nevolnosti, průjem.

Trvání léčby chronických forem hepatitidy trvá několik měsíců až rok, v závislosti na genotypu viru, stupni poškození těla a použitých léků. Protože hepatitida C primárně postihuje játra, pacienti musí dodržovat přísnou dietu.

Charakteristika HCV genotypů

loading...

Hepatitida C je jednou z nejnebezpečnějších virových hepatitid. Onemocnění je způsobeno virem obsahujícím RNA nazývaným Flaviviridae. Virus hepatitidy C se také nazývá "jemným vrahem". Takový neohrabaný epitet, který dostal kvůli skutečnosti, že v počáteční fázi není choroba doprovázena vůbec žádnými příznaky. Neexistují žádné známky klasické žloutenky, v oblasti správného hypochondria není žádná bolest. Identifikujte přítomnost viru nejdříve několik měsíců po infekci. A před tím neexistuje úplná reakce imunitního systému a není možné detekovat markery v krvi, a proto neexistuje možnost genotypizace. Zvláštností HCV je také to, že po vstupu do krevního řečiště během procesu rozmnožování virus začne rychle měnit. Takové mutace zasahují do imunitního systému infikovaných, aby se přizpůsobili a bojovali proti nemoci. Výsledkem je, že onemocnění může trvat několik let bez jakýchkoli příznaků, po nichž se objeví téměř cirhóza nebo maligní nádor. A v 85% případů je onemocnění z akutní formy chronické. Virus hepatitidy C má důležitý rys - rozmanitost genetické struktury. Ve skutečnosti je hepatitida C sbírka virů klasifikovaných podle jejich strukturních variant a rozdělena do genotypů a podtypů. Genotyp je souhrn genů kódujících dědičné rysy. Zatímco lék zná 11 genotypů viru hepatitidy C, které mají své vlastní podtypy. Genotyp je označen čísly od 1 do 11 (i když v klinických studiích se používá především genotyp 1 ÷ 6) a podtypy, používající písmena latinky:

V různých zemích jsou genotypy HCV distribuovány různými způsoby, například v Rusku se nejčastěji vyskytují od prvního po třetí. Závažnost průběhu onemocnění závisí na typu genotypu, určuje schéma léčby, její trvání a výsledek léčby.

Jako světové rozpětí HCV kmenů

loading...

Genotypy hepatitidy C jsou distribuovány heterogenně po celém světě, nejčastěji se vyskytují genotypy 1, 2 a 3 av některých oblastech vypadá takto:

  • v západní Evropě a ve východních oblastech jsou genotypy 1 a 2 nejčastější,
  • ve Spojených státech, podtypy 1a a 1b,
  • v severní Africe je nejběžnější genotyp 4.

Případné riziko infekce HCV jsou lidé s krevní onemocnění (nádory hematopoetického systému, hemofilie a další.), Stejně jako u pacientů leží na ošetření v dialyzačních jednotkách. Nejvíce obyčejný na světě je genotyp 1 - to odpovídá

50% z celkového počtu případů. Na druhém místě prevalence - genotyp 3 s trochu více než 30%. Rozložení HCV v Rusku má výrazné rozdíly ve srovnání se světovými nebo evropskými možnostmi:

  • genotyp 1b odpovídá

50% případů,

  • na genotypu 3a

    20%,

  • hepatitida 1a jsou infikovány

    10% pacientů,

  • byla nalezena hepatitida s genotypem 2

    Ale nejen genotyp závisí na obtížnosti terapie HCV. Účinnost léčby je ovlivněna také následujícími faktory:

    • věku pacientů. Možnost léčení mladých lidí je mnohem vyšší,
    • ženy mohou být vyléčeny jednodušší než muži,
    • významný stupeň poškození jater - výhoda výsledku je vyšší s menším poškozením,
    • velikost virové zátěže - méně virů v těle v době léčby, čím účinnější je terapie,
    • hmotnost pacienta: čím je vyšší, tím složitější je léčba.

    Proto léčebný režim zvolí ošetřující lékař na základě výše uvedených faktorů, genotypizace a doporučení EASL (Evropská asociace pro onemocnění jater). Agentura EASL doporučuje, aby její doporučení byla aktuální a jak se objevují nové účinné léky, doporučte doporučené režimy hepatitidy C.

    Kdo je ohrožen infekcí HCV?

    loading...

    Jak je známo, virus hepatitidy C se přenáší přes krev, a proto je nejpravděpodobnější, že se nakazí:

    • pacienti, kteří dostávají krevní transfúze,
    • pacientů a klientů v zubních ordinacích a zdravotnických zařízeních, kde nevhodně sterilizují lékařské přístroje,
    • díky nesterilním nástrojům může být nebezpečné navštívit manikúru a kosmetické salony,
    • z špatně vytvořených nástrojů mohou také trpět milovníky piercingu a tetování,
    • riziko infekce je vysoké u těch, kteří užívají drogy kvůli opakovanému použití nesterilních jehel,
    • může se plod infikovat matkou infikovanou hepatitidou C,
    • na sexuálním osvědčení nebo v činu se infekce může také dostat do organismu zdravé osoby.

    Co je léčba hepatitidou C?

    loading...

    Virus hepatitidy C nebyl marně považován za "něžný" virus-zabiják. Může se léta nezobrazovat, po níž se náhle objevuje ve formě komplikací doprovázených cirhózou nebo rakovinou jater. Ale diagnóza HCV dala na světě více než 177 milionů lidí. Léčba, která byla použita do roku 2013, kombinovaná injekce interferonu a ribavirinu poskytla pacientům šanci na hojení, která nepřesahuje 40-50%. Navíc byly doprovázeny vážnými a bolestivými vedlejšími účinky. Situace se v létě roku 2013 změnil, poté, co byl farmgigantom USA Gilead Sciences byly patentovány sofosbuvir je látka vypouštěna ve formě léku pod značkou Sovaldi, který je složen z 400 mg účinné látky. Stala se prvním přímým antivirotem (PDPD) v boji proti HCV. Výsledky klinických studií sofosbuvir potěšilo lékařskou účinnost, které je dosaženo v souladu s hodnotou genotypu 85 ÷ 95%, přičemž doba trvání průběhu léčby ve srovnání s léčbou interferonem a ribavirinem, více než o polovinu. A ačkoli Sofosbuvir patentoval farmaceutickou společnost Gilead, v roce 2007 jej syntetizoval Michael Sophia, zaměstnanec společnosti Pharmasett, který následně získal společnost Gilead Sciences. Ze jména Michaela, látka syntetizovaná jím byla nazývána sofosbuvirem. Sám Michael Sofia společně se skupinou vědců, kteří provedli řadu objevů, které odhalují povahu HCV, čímž se vytváří účinný lék ji léčit, vyhrál Lasker-DeBakey klinický lékařský výzkum pro. Zisk z implementace nového efektivního nástroje téměř udělal Gilead, který stanovil monopolní ceny na Sovvaldi. Navíc společnost obhájila svůj vývoj se speciálními patenty, podle nichž se Gilead a některé z jeho partnerských společností staly majiteli výlučného práva na výrobu původního PFDP. V důsledku toho Gilead dorazila během několika prvních dvou letech provádění této drogy opakovaně zablokovala veškeré náklady, které podnik vynaložené na pořízení Pharmasett, získávání patentů a dalších studiích.

    Co je Sofosbuvir?

    loading...

    Účinnost této drogy v boji proti HCV byla tak vysoká, že nyní téměř žádná schéma terapie není úplná bez její aplikace. Sophosbuvir se nedoporučuje používat jako monoterapie, avšak při složitém užívání vykazuje výjimečně vysoké výsledky. Zpočátku se lék užíval v kombinaci s ribavirinem a interferonem, což umožnilo v nekomplikovaných případech vyhledat lék za pouhých 29 týdnů. A to navzdory skutečnosti, že léčba interferonem a ribavirinem byla napůl naprosto účinná a její trvání někdy přesáhlo 40 týdnů. Po roce 2013 každý následující rok přinesl zprávy o vzniku stále více a více nových léků, které úspěšně bojují proti viru hepatitidy C:

    • v roce 2014 se objevil daklatasvir,
    • Rok 2015 byl rokem narození ladypasviry,
    • Roku 2016 byl spokojen s vytvořením velpatasvira.

    Daklataswir byl uvolněn přípravkem Bristol-Myers Squibb jako přípravek Daklinza obsahující 60 mg účinné složky. Dvě následující látky byly vytvořeny silami vědců z Gileadu a protože žádný z nich nebyl vhodný pro monoterapii, používaly se pouze léky v kombinaci se sofosbuvirem. Aby se usnadnila realizace terapie přípravkem Gilead, nově vytvořené léky byly okamžitě propuštěny v kombinaci se sophosbuvirem. Takže tam byly přípravky:

    • Harvoni, který kombinuje sophosbuvir 400 mg a ladypasvir 90 mg,
    • Epclusa, která zahrnovala 400 mg sofosbuviru a 100 mg velpatasviru.

    Při léčbě pomocí daklatasviry bylo nutné provést dvě různé přípravky Sowaldi a Daklinsu. Každá z párovaných kombinací účinných látek byla použita k léčbě určitých genotypů HCV podle terapeutických režimů doporučených EASL. A jen kombinace sophosbuvira a velpathasvir se ukázala jako pangenotypická (univerzální) lék. Eclusus vyléčil všechny genotypy hepatitidy C s prakticky stejnou vysokou účinností přibližně 97 ÷ 100%.

    Vzhled generik

    loading...

    Klinické studie potvrdily účinnost léčby, ale všechny tyto vysoce účinné léky měly jednu významnou nevýhodu - příliš vysoké ceny, které jim neumožňují koupit většinu nemocných. Monopolně vysoké ceny výrobků stanovených Galád, způsobil pobouření a skandál, který vyrobený držitelé patentů provést určité ústupky, takže některé společnosti z Indie, Pákistánu, Egyptě a licencí na výrobu analogy (generik) je tak efektivní a populární léky. Kromě toho boj s držiteli patentů, který nabízí léky na léčbu zaujatých cen, vedl Indii jako zemi, v níž žijí miliony pacientů s chronickou hepatitidou C. V důsledku tohoto boje Gilead vydal 11 indických společností licence a patentový vývoj pro sebevzdání nejprve sophosbuvira a pak další své nové drogy. Po obdržení licence indické výrobci rychle zřídili výrobu generických přípravků a přikládali vyráběným výrobkům své vlastní obchodní názvy. Nejprve se objevil Soveneri jenerkiki, pak Daklinza, Harvoni, Epclusa a Indie se stala světovým lídrem ve své produkci. Indickí výrobci na základě licenční smlouvy zaplatí 7% získaných prostředků ve prospěch držitelů patentů. Ale i při těchto platbách byly náklady na výrobu generik vyráběných v Indii desítkykrát nižší než náklady na originály.

    Mechanizmy působení

    loading...

    Jak již bylo uvedeno výše, nově vznikající novinky terapie HCV souvisí s PFDD a přímo ovlivňují virus. Zatímco interferon s ribavirinem, který byl dříve použit pro léčbu, posílil lidský imunitní systém a pomohl tělu odolat nemoci. Každá látka působí na virus způsobem:

    1. Sofosbuvir blokuje RNA polymerázu, čímž inhibuje replikaci viru.
    1. Daklatasvir, lepidavir a velpathaswir jsou inhibitory NS5A, které brání šíření virů a jejich vstup do zdravých buněk.

    Takovýto směrový efekt umožňuje úspěšně bojovat s HCV, podáním žádosti o léčbu sofosbuvire spárovaného s daklatasvirem, ledipasvirem, velpatasvirem. Někdy k posílení vlivu na virus je přidána třetí složka, která je nejčastěji ribavirinem.

    Výrobci generik z Indie

    loading...

    Společnosti země používají licence, které jim byly uděleny, a nyní Indie vyrábí tyto generiky Sovaldi:

    • Hepcvir je výrobcem společnosti Cipla Ltd.,
    • Hepcinat - Natco Pharma Ltd.,
    • Cimivir - Biocon sro # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • MyHep je výrobcem společnosti Mylan Pharmaceuticals Private Ltd.,
    • SoviHep - společnost Zydus Heptiza Ltd.,
    • Sofovir je výrobcem společnosti Hetero Drugs Ltd.,
    • Resof - vyrábí firmu Dr. Reddy # 8217, s laboratoře,
    • Virso - vydává Strides Arcolab.

    Daklinsa analogy také dělají v Indii:

    • Natdac z Natco Pharma,
    • Dacihep od Zydus Heptiza,
    • Daclahep z Hetero Drugs,
    • Dactovin od společnosti Strides Arcolab,
    • Daclawin od společnosti Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • Mydacla od firmy Mylan Pharmaceuticals.

    Následovat Gilead, indické výrobci léků také zvládli výrobu Harvoni, což vedlo k takovým generikům:

    • Ledifos - vydává Hetero,
    • Hepcinat LP - Natco,
    • Myhep LVIR - Mylan,
    • Hepcvir L - Cipla Ltd.,
    • Cimivir L-Biocon spol. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • LediHep - Zydus.

    A již v roce 2017 byla zahájena výroba následujících indických generik:

    • Velpanat uvolnil farmaceutickou společnost Natco Pharma,
    • vydání Velasof zvládl Hetero Drugs,
    • SoviHep V zahájil Zydus Heptiza.

    Jak vidíte, indické farmaceutické společnosti zaostávají za americkými výrobci, rychle zvládnou nově vyvinutá léčiva, při zachování všech kvalitativních, kvantitativních a terapeutických vlastností. Kromě toho včetně farmakokinetické bioekvivalence ve vztahu k originálům.

    Požadavky na generikum

    loading...

    Generika nazývaná lék, který je schopen nahradit základní léčiva patentem pro základní farmakologické vlastnosti. Mohou být propuštěny jak za přítomnosti, tak za nepřítomnosti licence, pouze jeho dostupnost činí vyrobenou analogovou licenci. V případě, že byla licence udělena indickým farmaceutickým společnostem, Gilead jim poskytl technologii výroby a poskytl držitelům licence právo na nezávislou cenovou politiku. Aby byl analog léčiv považován za obecný, musí odpovídat řadě parametrů:

    1. Je nutné sledovat poměr nejdůležitějších farmaceutických složek v přípravku podle kvalitativních i kvantitativních standardů.
    1. Dodržujte příslušné mezinárodní normy.
    1. Je nutné dodržovat řádné podmínky výroby.
    1. V přípravcích by měl být zachován ekvivalent ekvivalentu sacích parametrů.

    Je třeba poznamenat, že WHO se zavázala chránit přístupnost léčivých přípravků, které s pomocí generiků rozpočtu nahrazují drahé značkové léky s nimi.

    Egyptská generická sophosbuvira

    Na rozdíl od Indie, Egypta, farmaceutické firmy nemají porazil vůdce světové při výrobě dzhenenrikov od hepatitidy C, i když zvládli výrobu analogy sofosbuvir. Je pravda, že v převážné části analogů, které produkují, jsou bez licencí:

    • MPI Viropack vyrábí léčivo Marcyrl Pharmaceutical Industries # 8229, jedna z nejstarších egyptských generik,
    • Heterosofir, uvolněný společností Pharmed Healthcare. Je to jediný licencovaný generik v Egyptě. Na obalu pod hologramem je skrytý kód, který umožňuje ověřit originalitu produktu na webu výrobce, a vyloučit tak jeho padělání,
    • Grateziano, vyráběný společností Pharco Pharmaceuticals,
    • Sofolanork, produkovaný firmou Vimeo,
    • Sofocivir, vyráběný firmou ZetaPhar.

    Generika pro kontrolu hepatitidy z Bangladéše

    Další země, která vyrábí generiká ve velkých objemech proti HCV, je Bangladéš. Navíc, tato země není ani vyžadovat licenci pro výrobu analogů značkových léků, protože do roku 2030 to dovolilo farmaceutické firmy vyrábět takové lékařské přípravky bez řádných licenčních dokladů. Nejslavnější a vybavené nejmodernější technologií je farmaceutická společnost Beacon Pharmaceuticals Ltd. Projekt výrobních kapacit byl vytvořen evropskými specialisty a splňoval světové standardy. Beacon vyrábí tyto generiky pro léčbu viru hepatitidy C:

    • Soforal, generický název sophosbuvira, obsahuje účinnou látku o hmotnosti 400 mg. Na rozdíl od tradičních balení v lahvičkách o 28 kusů, přípravek Sophoral se vyrábí ve formě puchýřů s 8 tabletami na jedné desce,
    • Daklavir je generikum daklatasvira, jedna tableta obsahuje 60 mg účinné látky. Také je uvolňují ve formě puchýřů, ale každá deska obsahuje 10 tablet,
    • Sofosvel - obecný Epclusa obsahuje sofosbuvir velpatasvir 400 mg a 100 mg. Pangenotipny (multi) léčivo účinné v léčbě HCV genotypů 1 ÷ 6. V tomto případě není obvykle balení se do injekčních ampulí, Tablety jsou zabaleny do blistrů po 6 kusech v každé destičce.
    • Darvoni je komplexní přípravek, který kombinuje 400 mg somosbuviru a 60 mg daklatasvir. Je-li to nutné, kombinujte léčbu sofosbuvirem s daklatasvirem s použitím preparátů jiných výrobců, je nutné užít tablety každého druhu. A Beacon je složil do jedné pilulky. Přípravek Darvoni je balen v blistrech po 6 tabletách na jednom talíři, jenž je určen k vývozu.

    Při nákupu léků od firmy Beacon na základě léčby je třeba vzít v úvahu originálnost jejich balení, aby bylo možné koupit potřebné množství léku. Nejslavnější indické farmaceutické společnosti Jak bylo uvedeno výše, poté, co farmaceutické společnosti v zemi získaly licence na výrobu generik na terapii HCV, se Indie stala světovým lídrem ve své výrobě. Ale mezi mnoha společnostmi stojí za zmínku několik, jejichž výrobky v Rusku jsou nejznámější.

    Natco Pharma Ltd.

    Nejpopulárnější farmaceutická společnost Natco Pharma Ltd., léky, které zachránil životy několika desítek tisíc případů chronické formy hepatitidy C. zvládl výrobu téměř celé řady antivirotik přímé akce, včetně sofosbuvir s daklatasvirom a ledipasvir s velpatasvirom. Natco Pharma se objevil v roce 1981 ve městě Hyderabad se základním kapitálem 3,3 mil. Rupií, zatímco počet zaměstnanců činil 20 osob. Nyní v Indii zaměstnává pět podniků společnosti Natko 3 500 lidí a pobočky v jiných zemích. Vedle výrobních oddělení má firma dobře vybavené laboratoře, které umožňují vývoj moderních léků. Mezi jejím vývojem stojí za zmínku léky na potírání rakoviny. Jedním z nejznámějších léků v této oblasti je Veenat, vyráběný od roku 2003 a používaný v leukémii. Ano, a uvolnění generických přípravků pro léčbu viru hepatitidy C je prioritní oblastí společnosti Natco.

    Hetero Drugs Ltd.

    Cílem této společnosti je vyrábět generiká, které tuto touhu podřídily vlastní síti průmyslových odvětví, včetně továren s pobočkami a kancelářemi s laboratořemi. Výrobní síť Hetero je vězněna za výrobu léků na základě licencí získaných společností. Jedním ze směrů jeho činnosti jsou léky, které umožňují bojovat s vážnými virovými onemocněními, jejichž léčba u mnoha pacientů je nemožná kvůli vysokým nákladům na původní léky. Získaná licence umožňuje společnosti Hetero rychle začít s vydáváním generik, prodávaných za dostupnou cenu pro pacienty. Vytvoření heterových léků pochází z roku 1993. Za posledních 24 let se na území Indie objevilo tucet továren a desítky výrobních jednotek. Přítomnost vlastních laboratoří umožňuje společnosti provádět experimentální práci na syntéze látek, které přispěly k rozšíření výrobní základny ak aktivnímu exportu léčiv do zahraničí.

    Zydus Heptiza

    Zydus je indická společnost, která si stanovila za cíl vytvoření zdravé společnosti, která bude podle svých vlastníků následována změnou v lepší kvalitě života lidí. Cílem je ušlechtilý, a proto k dosažení tohoto cíle společnost provádí aktivní vzdělávací aktivity, které postihují nejchudší části populace země. Včetně bezplatného očkování populace proti hepatitidě B. Zidus, pokud jde o výkon na indickém farmaceutickém trhu, je na čtvrtém místě. Navíc bylo 16 svých výrobků zařazeno do seznamu 300 esenciálních léků indického farmaceutického průmyslu. Zydus produkty jsou poptávka nejen na domácím trhu, ale lze nalézt v lékárnách 43 zemí naší planety. A sortiment léčivých přípravků vyráběných u 7 podniků přesahuje 850 přípravků. Jeden z nejsilnějších výrobních zařízení je ve státě Gujarat a patří k největším nejen v Indii, ale také v Asii.

    HCV terapie 2017

    Léčebné režimy pro hepatitidu C pro každého pacienta jsou individuálně zvoleny lékařem. Pro správný, efektivní a bezpečný výběr režimu musí lékař vědět:

    • genotyp viru,
    • délka trvání nemoci,
    • stupeň poškození jater,
    • přítomnost / nepřítomnost cirhózy, souběžné infekce (např. HIV nebo jiná hepatitida), negativní zkušenost s předchozí léčbou.

    Po obdržení těchto údajů po provedení cyklu analýz zvolí lékař na základě doporučení nejlepší variant léčby. Doporučení EASL jsou rok od roku opravena a přidávají se nové léky. Před doporučením nových terapií se předkládají Kongresu nebo zvláštní schůzka k posouzení. V roce 2017 se na zvláštním zasedání EASL uvažovalo o aktualizaci doporučených schémat v Paříži. Bylo rozhodnuto úplné zastavení léčby interferonem v léčbě HCV v Evropě. Navíc neexistovala žádná doporučená schéma s použitím jediného léku přímého účinku. Zde je několik doporučených možností léčby. Všechny jsou uvedeny pouze jako reference a nemohou se stát příručkou k jednání, jelikož jmenování terapie může být uděleno pouze lékařem, pod jehož dohledem později projde.

    1. Možné léčebný režim navržené EASLv případ monoinfection hepatitidy C nebo HIV ko-infekce HCV + pacientů bez cirhózy a bez předchozí léčby:
    • pro léčbu genotypů 1a a 1b můžete použít:

    # 8229, sofosbuvir + ledipasvir, bez ribavirinu, trvání 29 týdnů, # 8229, sophosbuvir + daklatasvir, také bez ribavirinu, léčba trvá 29 týdnů, # 8229 nebo sofosbuvir + velpatasvir bez ribavirinu, trvání kurzu je 29 týdnů.

    • s terapií genotyp 2 platí bez ribavirinu po dobu 29 týdnů:

    # 8229, sofosbuvir + dklatasvir, # 8229 nebo sophosbuvir + velpathaswir.

    • v léčbě genotyp 3 bez použití ribavirinu po dobu 29 týdnů léčby:

    # 8229, sophosbuvir + daklutasvir, # 8229 nebo sofosbuvir + velpatasvir.

    • s terapií genotyp 4 je možné aplikovat bez ribavirinu po dobu 29 týdnů:

    # 8229, sofosbuvir + ledipasvir, # 8229, sophosbuvir + daklutasvir, # 8229 nebo sofosbuvir + velpatasvir.

    1. Doporučená EASL režimy monoinfection s hepatitidou C nebo HIV ko / HCV infekce u pacientů s kompenzovanou cirhózou, bez předchozí léčby:
    • pro léčbu genotypů 1a a 1b můžete použít:

    # 8229, sofosbuvirem + ledipasvir s ribavirinem, trvání 29 týdnů, # 8229 nebo 24 týdnů bez ribavirinu, # 8229 a další možnost - 24 týdnů s ribavirinem s nepříznivou prognózou odpovědi, # 8229, sophosbuvir + daklutasvir, pokud nebyl podáván ribavirin, pak 24 týdnů a při léčbě ribavirinem 29 týdnů, # 8229 nebo sofosbuvirem + velpatasvir bez ribavirinu, 29 týdnů.

    # 8229, sofosbuvirem + dklatasvir bez ribavirinu po dobu 29 týdnů as ribavirinem pro nepříznivou prognózu 24 týdnů, # 8229 nebo sophosbuvir + velpathaswir bez kombinace s ribavirinem po dobu 29 týdnů.

    # 8229, sophosbuvir + daklatasvir po dobu 24 týdnů s ribavirinem, # 8229 nebo sofosbuvir + velpatasvir opět s ribavirinem, léčba trvá 29 týdnů, # 8229, je možná varianta софосбувир + велпатасвир 24 týdnů, ale již bez rybavíry.

    • s terapií genotyp 4 používat stejné schémata jako u genotypů 1a a 1b.

    Jak můžete vidět, výsledek terapie je ovlivněn kombinací předepsaných léků kromě stavu pacienta a vlastností jeho těla. Délka léčby navíc závisí na kombinaci vybrané lékařem.

    Léčba moderními léky z HCV

    Užívejte tablety přípravků s přímým antivirovým účinkem, které lékař předepisuje perorálně jednou denně. Nejsou rozděleny na části, nejsou žvýkány, jsou omyty čistou vodou. Nejlepší je udělat to současně, a tak udržovat konstantní koncentraci v těle účinných látek. Vázat na načasování příjmu jídla není nutné, hlavní věc - nedělejte to na prázdný žaludek. Po začátku užívání léků věnujte pozornost zdravotnímu stavu, protože v tomto období je nejsnadněji zaznamenáno možné vedlejší účinky. Oni samy nemají hodně PDPD, ale léky předepsané v komplexu jsou mnohem menší. Nejčastěji se vedlejší účinky projevují jako:

    • bolesti hlavy,
    • zvracení a závratě,
    • obecná slabost,
    • zhoršení chuti k jídlu,
    • bolest v kloubech,
    • změny v biochemických hladinách v krvi, vyjádřené nízkou hladinou hemoglobinu, pokles počtu krevních destiček a lymfocytů.

    Nepříznivé projevy jsou možné u malého počtu pacientů. Ale přesto by všechny hlášené nemoci měly být oznámeny ošetřujícímu lékaři, aby přijal nezbytná opatření. Aby nedošlo ke zvýšení nežádoucích účinků, je třeba vyloučit alkohol a nikotin, protože mají nepříznivý vliv na játra.

    Kontraindikace

    V některých případech je přijetí PDPD vyloučeno, týká se:

    • individuální přecitlivělost pacientů na některé složky léčivých přípravků,
    • pacientů mladších 18 let, protože nejsou k dispozici přesné údaje o jejich účincích na tělo,
    • ženy s plodem a pečovatelem,
    • ženy by měly používat spolehlivé metody antikoncepce, aby se zabránilo koncepci během léčby. A tento požadavek platí i pro ženy, jejichž partneři také podstoupili terapii PADA.

    Skladujte antivirová léčiva přímého účinku v místech nepřístupných dětem a účinkům přímého slunečního záření. Skladovací teplota by měla být v rozmezí 15 ÷ 30 ° C. Při užívání léků zkontrolujte jejich dobu výroby a skladování na obalu. Zbytečné léky jsou zakázány. Jak koupit PPPD ruským občanům Bohužel, nemůžete najít indické generiká v ruských lékárnách. Farmaceutická společnost Gilead, která udělila povolení k výrobě přípravků, obezřetně zakázala svůj vývoz do mnoha zemí. Včetně všech evropských zemí. Ti, kteří chtějí koupit rozpočet indické generiky pro boj s hepatitidou C, mohou využít několik způsobů:

    • objednávejte je přes ruské online lékárny a obdržíte zboží za několik hodin (nebo dnů) v závislosti na místě dodání. A ve většině případů nebude zaplacena ani záloha,
    • objednávejte je prostřednictvím indických internetových obchodů s dodávkou domů. Bude vyžadovat předplatné v měně a čekací doba bude trvat tři týdny až měsíc. Navíc přidáte potřebu komunikovat s prodejcem v angličtině,
    • jděte do Indie a přiveďte drogu sami. Bude to také čas, plus jazyková bariéra a složitost kontroly originality zboží zakoupeného v lékárně. Ke všemu problému nezávislého vývozu, který vyžaduje termotransfer, dostupnost lékařského závěru a předpisu v angličtině a kopie šeku, budou také přidány.

    Ti, kteří mají zájem o nákup léků, rozhodnou sami o tom, které z možných možností doručení si zvolí. Nezapomeňte, že v případě HCV závisí příznivý výsledek léčby na rychlosti jejího nástupu. Zde v doslovném smyslu je zpoždění smrti podobné, a proto není vhodné odložit zahájení postupu.